ELISA-Ablaufschritte

Operativer Ablauf

• Antikörperbeschichtung: Verdünnen Sie den Beschichtungsantikörper auf die erforderliche Verdünnung unter Verwendung eines Carbonatpuffers (CBS) oder Pufferisierten Salzlösung (PBS) entsprechend den experimentellen Anforderungen. Beschichten Sie 100 μL pro Loch, inkubieren Sie bei 37°C für 2 Stunden oder bei 4°C über Nacht.
• Entleeren Sie die Flüssigkeit in den Löchern, trocknen Sie aus und waschen Sie das Plättchen zweimal mit 10 mM PBST (10 mM PBS + 0,05% Tween-20), jedes Mal einweichen für 1-2 Minuten, 350 μL pro Loch, und trocknen Sie es (Sie können das Plättchen auch leicht klopfen, um die Flüssigkeit aus den Löchern zu entfernen).
• Blockieren Sie mit 10 mM PBST (10 mM PBS + 0,05% Tween-20) enthaltend entweder 1% BSA oder 5% Magermilch unter Verwendung von 350-400 μL pro Loch bei 37°C für 2 Stunden.
• Waschen des Plättchens: folgen Sie Schritt 2.                Hinweis: Kommerzielle Kits kommen normalerweise bereits vorbeschichtet mit fangenden Antikörpern auf den ELISA-Plättchen, daher sind Schritte 1-4 im Allgemeinen unnötig. Bitte überprüfen Sie dies vor der Verwendung.
• Hinzufügen von Proben: Richten Sie Null-Löcher, Standardlöcher und Prob Löcher ein. Geben Sie 100 μL Probenverdünner in die Blindlöcher hinzu und geben Sie 100 μL Standard oder Probe in den restlichen Löchern                Hinweis: vermeiden Sie Blasen, geben Sie die Probe auf den Boden des Lochs hinzu, versuchen Sie nicht an der Lochwand zu berühren und vervollständigen Sie das Hinzufügen von Proben innerhalb von 10 Minuten.                Decken Sie das ELISA-Plättchen mit einem Deckel oder Film ab und inkubieren Sie bei 37°C für 60-120 Minuten. Um die Gültigkeit der experimentellen Ergebnisse zu gewährleisten, verwenden Sie bitte eine neue Standardlösung für jedes Experiment.
• Entleeren Sie die Flüssigkeit in den Löchern, trocknen Sie aus und waschen Sie das Plättchen 4-mal mit 10 mM PBST (10 mM PBS + 0,05% Tween-20), jedes Mal einweichen für 1-2 Minuten, unter Verwendung von 350-400 μL pro Loch, und trocknen Sie es (Sie können das Plättchen auch leicht klopfen, um die Flüssigkeit aus den Löchern zu entfernen).
• Hinzufügen des Nachweis-Antikörpers: Verdünnen Sie den Nachweis-Antikörper entsprechend den experimentellen Anforderungen mit PBST auf eine bestimmte Verdünnung, 100 μL pro Loch, bei 37°C für 1 Stunde.
• Waschen des Plättchens: wie Schritt 6.
• Hinzufügen des sekundären Antikörpers: Verdünnen Sie den sekundären Antikörper mit 10 mM PBST auf die erforderliche Verdünnung, geben Sie 100 μL pro Loch hinzu und inkubieren Sie bei 37°C für 1 Stunde.
• Waschen des Plättchens: wie Schritt 6.
• Hinzufügen von TMB: Geben Sie 100μL der TMB-Substratlösung in jedes Loch hinzu, inkubieren Sie bei 37°C im Dunkeln für 10-30 Minuten (passen Sie die Zeit entsprechend den experimentellen Anforderungen an, um übermäßige Farbentwicklung zu vermeiden).
• Hinzufügen von Stopplösung: Nach dem Erreichen der erwarteten Farbbildung (z.B. eine gestaffelte Farbe in den Standardlöchern sichtbar), geben Sie 50μL der Stopplösung (z.B. 2M Citronensäure) in jedes Loch hinzu, um die enzymatische Reaktion zu beenden (an diesem Punkt ändert sich die blaue Farbe zu Gelb).
• ELISA-Lesung: Verwenden Sie 630 nm als Kalibrierwellenlänge, messen Sie die Absorption (OD-Wert) jedes Lochs bei 450 nm mit einem ELISA-Reader nacheinander. Lesen Sie die Werte innerhalb von 5 Minuten nach dem Hinzufügen der Stopplösung.