ELISA

Die Matrix bezieht sich auf alle Komponenten eines Probenmaterials außer dem analysierten Zielstoff, wie Proteine, Lipide, Salze, Pigmente und kleine organische Moleküle im Probenmaterial. Der Matrix-Effekt ist ein Phänomen, bei dem diese Matrixkomponenten mit dem analysierten Zielstoff oder dem Analyseverfahren interagieren, was die Trennung, Extraktion des analisierten Zielstoffs oder die Detektion reize und letztendlich zu Abweichungen der Analyseergebnisse von den tatsächlichen Werten führt. Diese Art von Störung ist in biologischen Proben wie Serum, Plasma, Zerebrospinalflüssigkeit, Gewebehomogenaten und Zellkulturmedien weit verbreitet und ist eine häufige Ursache für ungenaue Reproduzierbarkeit und falsche Quantifizierung in ELISA-Experimenten.

ELISA ist eines der grundlegenden Experimente in der Immunologie, und die meisten Forscher im Bereich der Lebenswissenschaften sind damit vertraut. Aufgrund ihrer Eigenschaften wie starken Spezifität, hoher Empfindlichkeit und genauer Quantifizierung wird die ELISA-Technologie sowohl in der Grundlagenforschung als auch in der klinischen Diagnostik häufig eingesetzt. Man geht davon aus, dass viele unserer Follower, die uns beobachten, ebenfalls ELISA-Experimente durchgeführt haben. Wir haben eine Liste der häufigsten Probleme, die während von ELISA-Experimenten auftreten können, zusammengestellt, damit Sie sich daran orientieren können.

Der am häufigsten verwendete festphasige Träger in ELISA ist die aus Polystyrol bestehende Mikroplattform. Die Adsorption von Proteinen bildet die Grundlage des gesamten Detektionssystems, und der Kernprinzip dieser Methode liegt in den nicht-kovalenten Wechselwirkungen zwischen der Oberfläche des festphasigen Materials und Proteinmolekülen.

Die Beschichtung ist der Prozess des Fixierens spezifischer Antikörper oder Antigene auf die Oberfläche eines festphasigen Trägermaterials. Die Qualität hat direkten Einfluss auf die Empfindlichkeit, Spezifität und Reproduzierbarkeit des Experiments. Es entspricht der Schaffung einer „exklusiven Reaktionsplattform“ für anschließende Antigene-Antikörper-Reaktionen.

Es gibt unterschiedliche Ansichten bezüglich der Erkennung und Klassifizierung von ELISA, und verschiedene Fachliteraturen haben jeweils unterschiedliche Klassifikationsansätze hinsichtlich des Prinzips oder der Arbeitsweise. Hier teilen wir ELISA in die folgenden vier Kategorien ein und erklären dann jede Kategorie im Detail: (1) Direktes ELISA; (2) Indirektes ELISA; (3) Sandwich-ELISA; (4) Wettbewerbshemmende ELISA. Weitere Arten von ELISA sind mit diesen vier Typen verbunden oder abgeleitet.

Enzymetierte Antikörpertechnologie ist eine Markierungstechnik, bei der Enzymmoleküle kovalent mit spezifischen Antikörpern verbunden werden. Ihr grundlegender Prinzip ist: Die hohe Spezifität des Antikörpers für die Erkennung von Antigenen zu nutzen als "Zielsystem", um das Zielmolekül präzise zu lokalisieren; anschließend wird der hocheffiziente katalytische "Verstärkungseffekt" des Enzyms auf sein Substrat genutzt, um eine unsichtbare Immunreaktion in ein sichtbares oder von Instrumenten nachverfolgbares Signal zu verwandeln (wie z. B. Farbänderungen, Lumineszenz usw.). Dies ermöglicht die qualitativ, lokalisierende oder quantitative Analyse des Zielantigens oder Antikörpers.

Hochwertige Vergangenheit – Kein Signal. Zu viel Signal – die gesamte Platte wird gleichmäßig blau. Standardkurve erreicht, aber schlechte Unterscheidung zwischen Punkten. Schlechte Duplikate. Schlechte Reproduzierbarkeit der Tests. Kein Signal, obwohl ein Signal erwartet wird, die Standardkurve scheint jedoch in Ordnung zu sein. Die Messwerte der Proben sind zu hoch, aber die Standardkurve scheint in Ordnung zu sein. Sehr niedrige Messwerte über die gesamte Platte. Bei Zugabe von Stop-Lösung entwickelt sich ein Grünton, wenn Streptavidin-HRP verwendet wird. Randeffekte.

Je nach Erkennungsziel unterscheiden sich die gängigen Typen von ELISA: der indirekte Ansatz (für die Messung von Antikörpern), die doppelte Antikörper-Sandwich-Methode (für die Messung von Antigenen) und konkurrenzbasierte Methoden. Unter diesen werden die doppelte Antikörper-Sandwich-Methode und der indirekte Ansatz am häufigsten eingesetzt. Im folgenden Beispiel werden die standardmäßigen Arbeitsverfahren sowie wichtige Aspekte der doppelten Antikörper-Sandwich-Methode detailliert beschrieben.

Die unten aufgeführten Bedingungen für die Samelldeckung und Lagerung von ELISA-Proben dienen als allgemeine Richtlinien. Spezifische Protokolle können je nach Zelllinie oder Gewebetyp variieren. Wenn die Proben über einen längeren Zeitraum aufbewahrt werden sollen, wird eine Prüfung der Stabilität der Proben empfohlen. Vermeiden Sie wiederholte Gefrier-Tau-Cycler für alle Probandtypen.

Diese drei Techniken – RIA, ELISA und Western blot – sind grundlegende Immunassay-Techniken in der Biomedizin, die zur Detektion spezifischer Biomoleküle verwendet werden (wie Proteine, Hormone, Antikörper). Ihre wesentlichen Unterschiede liegen in ihrem Detektionsprinzip, dem zielgruppenorientierten Molekül, der Empfindlichkeit, Spezifität, Durchsatzrate und Anwendungsmöglichkeiten.