Fehlerbehebung: ELISA
Problem: Hoher Hintergrund
| Mögliche Quelle | Test oder Aktion |
|---|---|
| Unzureichendes Waschen | Anzahl der Waschungen erhöhen; 30 Sekunden Einweichen zwischen den Waschungen hinzufügen |
Problem: Kein Signal, wenn ein Signal erwartet wird
| Mögliche Quelle | Test oder Aktion |
|---|---|
| Reagenzien in falscher Reihenfolge hinzugefügt oder falsch hergestellt | Versuch wiederholen; Berechnungen überprüfen und neue Puffer, Standards usw. herstellen. Protokoll überprüfen |
| HRP ist kontaminiert | Frische Reagenzien verwenden |
| Nicht genug Antikörper verwendet | Konzentration erhöhen |
| Standard ist verdorben (wenn Signale in den Probenwellen vorhanden sind) | Überprüfen, ob Standard gemäß Anleitung behandelt wurde. Neuen Flakon verwenden. |
| Puffer mit FCS verwendet zum Rekonstituieren von Antikörpern | Ihre bevorzugten Reagenzien neu qualifizieren |
| Antikörper-bindendes Protein hat nicht an Platte gebunden | Einen ELISA-Platte verwenden (nicht eine Zellkulturplatte) In PBS ohne zusätzliches Protein verdünnen |
| Puffer kontaminiert | Frische Puffer herstellen |
Problem: Zu viel Signal - ganze Platte gleichmäßig blau
| Mögliche Quelle | Test oder Aktion |
|---|---|
| Unzureichendes Waschen/Waschschritt übersprungen - ungebundenes Peroxidase verbleibend | Sorgfältiges Waschen zwischen den Schritten sicherstellen. |
| Substratlösung zu früh gemischt und blau geworden | Substratlösung sollte sofort nach dem Mischen verwendet werden |
| Zu viel Streptavidin-HRP | Dilution überprüfen, bei Bedarf titrieren |
| Plattenverschlüsse oder Reagenzienreservoirs wiederverwendet, was zur Anwesenheit von restlichem HRP führt. Dies wird TMB unspezifisch blau färben | Frisches Plattenverschluss und Reagenzienreservoir für jeden Schritt verwenden |
| Puffer kontaminiert mit Metallen oder HRP | Frische Puffer herstellen |
Problem: Standardkurve erreicht aber poor Unterscheidung zwischen Punkten (niedrige oder flache Kurve)
| Mögliche Quelle | Test oder Aktion |
|---|---|
| Nicht genug Streptavidin-HRP | Dilution überprüfen, bei Bedarf titrieren |
| Capture-Antikörper hat nicht gut an Platte gebunden | Einen ELISA-Platte verwenden (nicht eine Zellkulturplatte) In PBS ohne zusätzliches Protein verdünnen |
| Nicht genug Detektionsantikörper | Dilution überprüfen, bei Bedarf titrieren |
| Platte nicht lange genug entwickelt | Substratlösung Inkubationszeit erhöhen Empfohlene Marke der Substratlösung verwenden |
| Falsches Verfahren | Zurück zu allgemeinem ELISA-Protokoll; Modifikationen eliminieren, falls vorhanden |
| Ungerechtfertigte Berechnung von Standardkurven-Dilutionen | Berechnungen überprüfen, neue Standardkurve herstellen |
Problem: Schlechte Duplikate
| Mögliche Quelle | Test oder Aktion |
|---|---|
| Unzureichendes Waschen | If using an automatic plate washer, check that all ports are clean and free of obstructions, add a 30 second soak step und rotieren Platte halfway durch das Waschen |
| Ungleiche Plattenbeschichtung aufgrund von Verfahrensfehler oder schlechter Plattenqualität (kann ungleichmäßig binden) | In PBS ohne zusätzliches Protein verdünnen Beschichtungs- und Blockierungsvolumina, Zeiten und Methode der Reagenzien-Zugabe überprüfen. Platte verwendet werden Einen ELISA-Platte verwenden (nicht eine Zellkulturplatte) |
| Plattenverschlüsse wiederverwendet | Frischen Plattenverschluss für jeden Schritt verwenden |
| Keine Plattenverschlüsse verwendet | Plattenverschlüsse verwenden |
| Puffer kontaminiert | Frische Puffer herstellen |
Problem: Schlechte assay-zu-assay Reproduzierbarkeit
| Mögliche Quelle | Test oder Aktion |
|---|---|
| Unzureichendes Waschen | If using an automatic plate washer, check that all ports are clean und free of obstructions |
| Variationen in Inkubationstemperatur | Empfohlene Inkubationstemperatur befolgen Vermeiden, Platten zu inkubieren in Bereichen wo Umweltbedingungen variieren |
| Variationen im Protokoll | Gleiches Protokoll von Durchlauf zu Durchlauf befolgen |
| Plattenverschlüsse wiederverwendet, was zur Anwesenheit von restlichem HRP führt das TMB blau färben wird | Frischen Plattenverschluss für jeden Schritt verwenden |
| Ungerechtfertigte Berechnung von Standardkurven-Dilutionen | Berechnungen überprüfen, neue Standardkurve herstellen Interne Kontrollen verwenden |
| Puffer kontaminiert | Frische Puffer herstellen |
Problem: Kein Signal wenn ein Signal erwartet wird, aber Standardkurve sieht gut aus
| Mögliche Quelle | Test oder Aktion |
|---|---|
| Kein Zytokin in Probe | Interne Kontrollen verwenden Versuch wiederholen, experimentelle Parameter neu überdenken |
| Probenmatrix maskiert Detektion | Proben mindestens 1:2 verdünnen in geeignetem Verdünnungsmittel, oder bevorzugt, eine Reihe von Verdünnungen durchführen um Recovery zu sehen |
Problem: Proben lesen zu hoch, aber Standardkurve sieht gut aus
| Mögliche Quelle | Test oder Aktion |
|---|---|
| Proben enthalten Zytokin-Stufen über Assay-Reichweite | Proben verdünnen und erneut ausführen |
Problem: Sehr niedrige Lesungen über die gesamte Platte
| Mögliche Quelle | Test oder Aktion |
|---|---|
| Falsche Wellenlängen | Filter/Reader überprüfen |
| Unzureichende Entwicklungszeit | Entwicklungszeit erhöhen |
| Beschichtete Platten sind alt und sind verdorben | Neue Platten beschichten |
| Capture-Antikörper hat nicht an die Platte gebunden | Einen ELISA-Platte verwenden (nicht eine Zellkulturplatte) In PBS ohne zusätzliches Protein verdünnen |
| Puffer mit FCS verwendet zum Rekonstituieren von Antikörpern | Ihre bevorzugten Reagenzien neu qualifizieren |
Problem: Grüne Farbe entwickelt bei Zugabe der Stop-Lösung wenn Streptavidin-HRP verwendet
| Mögliche Quelle | Test oder Aktion |
|---|---|
| Reagenzien nicht gut genug in Wellen gemischt | Platte tippen |
Problem: Randeffekte
| Mögliche Quelle | Test oder Aktion |
|---|---|
| Ungleiche Temperaturen um Arbeitsfläche | Vermeiden, Platten zu inkubieren in Bereichen wo Umweltbedingungen variieren |
| Plattenverschlüsse verwenden |
Problem: Drift
| Mögliche Quelle | Test oder Aktion |
|---|---|
| Unterbrochene Assay-Einrichtung | Assay-Einrichtung sollte kontinuierlich sein - alle Standards und Proben vor Beginn des Assays entsprechend herstellen |
| Reagenzien nicht bei Raumtemperatur | Sicherstellen, dass alle Reagenzien bei Raumtemperatur sind bevor sie in die Wells pipettiert werden es sei denn anders in den Antikörper-Einsätzen instruiert |