ELISA-Tests
ELISAs können verwendet werden, um Antigene und auch Antikörper zu bestimmen. Für diesen Assay sind drei notwendige Reagenzien erforderlich: (1) Antigene oder Antikörper, die an Festphasen-Trägern adsorbiert wurden. (2) Enzym-markierte Antigene oder Antikörper. (3) Substrate für enzymatische Reaktionen. Je nach Quelle des Reagenziums und der Probe sowie den spezifischen Testbedingungen können verschiedene Testmethoden entwickelt werden.
Es gibt unterschiedliche Meinungen zur Detektion und Klassifizierung von ELISAs, und verschiedene Literaturquellen haben unterschiedliche Einstufungsoptionen hinsichtlich Prinzip oder Operation. Hier unterteilen wir ELISA in die folgenden vier Kategorien und erläutern jede Kategorie im Detail: (1) direkter ELISA; (2) indirekter ELISA; (3) Sandwich-ELISA; (4) Kompetitions-Hemmungs-ELISA. Alle anderen ELISA-Methoden gehören zu diesen vier ELISA-Typen oder leiten sich aus Kombinationen dieser vier ELISA-Typen ab.
1. Direkter ELISA
Der direkte ELISA ist der einfachste Typ von ELISA in Bezug auf das Verfahren. Seine Methode umfasst die direkte Beschichtung eines Antigens oder Antikörpers auf einen Festphasen-Träger, gefolgt von einer spezifischen Bindung mit einem enzym-markierten Antikörper oder Antigen und anschließend dem Einsetzen des Enzyms zur katalytischen Farbentwicklung des Substrats. Die Tiefe der entwickelten Farbe ist proportional zur Menge des hinzugefügten enzym-markierten Antikörpers oder Antigens. Obwohl der direkte ELISA sehr einfach zu bedienen ist und relativ kurze Schritte aufweist, bleibt sein Anwendungsbereich dennoch begrenzt. Ein wichtiger Grund dafür ist, dass in diesem ELISA-Typ nur eine Stufe der Signalverstärkung involviert ist, sodass seine Empfindlichkeit nicht sehr hoch ist. Darüber hinaus sind die Substanzen, die er detektieren kann, ebenfalls sehr begrenzt, da er nur enzym-markierte Moleküle messen kann.
2. Indirekter ELISA
Der indirekte ELISA wird häufig zur Antikörperdetektion verwendet. Seine anfänglichen Verfahrensschritte stimmen weitgehend mit denen des direkten ELISA überein, wobei der Hauptunterschied darin besteht, dass bei einem indirekten ELISA das Molekül, das an den vorgeschichteten Antigen bindet, ein unlabeled Antikörper ist, anstatt eines enzym-markierten. Anschließend wird ein zweiter Antikörper hinzugefügt; dieser sekundäre Antikörper ist enzym-markiert und kann spezifisch an den primären Antikörper binden. Schließlich wird ein Substrat eingeführt, um die Farbentwicklung zu induzieren, und die Ergebnisse werden interpretiert. Wenn die Konzentration des sekundären Antikörpers festgelegt ist, korreliert die finale Intensität der Farbentwicklung positiv mit der Menge des primären Antikörpers.
Da sekundäre Antikörper im Allgemeinen polyklonale Antikörper sind, können mehrere sekundäre Antikörpermoleküle an ein einzelnes primäres Antikörpermolekül binden. Gleichzeitig können mehrere Enzymmoleküle mit einem sekundären Antikörpermolekül konjugiert werden, was die Detektionsempfindlichkeit erheblich verbessert. Zusätzlich sind sekundäre Antikörper relativ einfach herzustellen und stehen seit langem kommerziell zur Verfügung. Dadurch wird das Bedürfnis der Operateure entfallen, primäre Antikörper mit Enzymen zu markieren, was die Arbeitslast deutlich reduziert.
Der indirekte ELISA spielt eine entscheidende Rolle bei der Bestimmung von Antikörper-Titern, Serumtitern und dem Screening von monoklonalen Antikörpern. In der klinischen Diagnostik dient er auch als wichtige Methode zur Detektion von Marker-Antikörpern.
3. Sandwich-ELISA
Im Allgemeinen kann der Sandwich-ELISA in zwei Typen unterteilt werden: direkter Sandwich-ELISA und indirekter Sandwich-ELISA.
Direkter Sandwich-ELISA kann weiter in zwei Untergruppen unterteilt werden: doppelter-Antikörper-Sandwich-ELISA und doppeltes-Antigen-Sandwich-ELISA.
Doppelter-Antikörper-Sandwich-ELISA Der erste Antikörper (Fangantikörper) wird auf einen Festphasen-Träger beschichtet. Anschließend wird das zu detektierende Antigen hinzugefügt. Nach der Inkubation wird der zweite Antikörper (Detektionsantikörper) eingeführt. Der Fangantikörper und der Detektionsantikörper können entweder zwei monoklonale Antikörper sein, die verschiedene Epitope targeten, oder ein monoklonaler Antikörper und ein polyklonaler Antikörper, die das gleiche Antigen targeten. Der Detektionsantikörper muss jedoch enzym-markiert sein. Für den doppelten-Antikörper-Sandwich-ELISA muss das Zielanalyt (das zu detektierende Antigen) zwei oder mehr Epitope enthalten; andernfalls kann der Detektionsantikörper nicht an das Antigen binden. Beispielsweise können Haptene und kleine Molekül-Antigene mit dem doppelten-Antikörper-Sandwich-ELISA nicht detektiert werden.
Doppeltes-Antigen-Sandwich-ELISA Die Operation ist im Wesentlichen die gleiche wie bei dem doppelten-Antikörper-Sandwich-Assay. Der Unterschied besteht darin, dass das beschichtete Substanz ein Antigen ist, das Objekt zu detektieren ein Antikörper, gefolgt von der Hinzufügung eines enzym-markierten Antigens und dann einem Substrat zur Induzierung der Farbentwicklung. Das grundlegende operative Verfahren des doppelten-Antigen-Sandwich-ELISA entspricht im Großen und Ganzen dem des indirekten ELISA, aber der Kernunterschied liegt darin, dass er ein spezifisches Antigen verwendet anstatt des enzym-markierten sekundären Antikörpers, der beim indirekten ELISA verwendet wird. Dieses Design ermöglicht das Screening durch die spezifische Bindung von zwei Antigenen an den Ziel-Antikörper und reduziert effektiv störende Faktoren wie nicht-spezifische Antikörper und Kreuzreaktionen, sodass seine Detektionsspezifität besser ist als bei dem indirekten ELISA. Diese Methode hat jedoch auch offensichtliche technische Kostengrenzen: Sie erfordert die gleichzeitige Vorbereitung von zwei Schlüsseltreibern, dem beschichteten Antigen und dem enzym-markierten Antigen, und es gibt strenge Anforderungen an die Reinheit und Aktivitätsstabilität dieser beiden Antigene, was zu deutlich höheren gesamten Forschungs- und Entwicklungskosten führt als bei dem indirekten ELISA.
Indirekter Sandwich-ELISA Sein Prinzip ist wie folgt: Ein art-spezifischer Antikörper wird auf einen Festphasen-Träger beschichtet, um als Fangantikörper zu dienen. Nach einem Blockierungsschritt wird das zu detektierende Antigen hinzugefügt und inkubiert. Nach dem Waschen wird ein weiterer art-spezifischer Antikörper hinzugefügt, der als Detektionsantikörper dient. Schließlich wird ein enzym-markierter sekundärer Antikörper eingeführt, und anschließend wird ein Substrat hinzugefügt, um die Farbentwicklung zu induzieren.
Im Vergleich zum direkten doppelten-Antikörper-Sandwich-ELISA integriert der indirekte Sandwich-ELISA einen enzym-markierten sekundären Antikörper, der spezifisch den Detektionsantikörper erkennt. Dies ist gleichbedeutend mit dem Hinzufügen eines zusätzlichen Signalverstärkungsschritts für das gesamte System und macht die endgültigen Ergebnisse empfindlicher als bei dem direkten doppelten-Antikörper-Sandwich-ELISA. Gleichzeitig kann der enzym-markierte sekundäre Antikörper im indirekten Sandwich-ELISA nur den Detektionsantikörper, aber nicht den Fangantikörper erkennen, sodass auch die Spezifität des Systems gewährleistet ist. Daher übernehmen die meisten unserer ELISA-Kits diese Methode, insgesamt über zweitausend. Wenn Sie Bedürfnisse haben, kontaktieren Sie uns bitte. Besuchen Sie unsere Website, um ELISA-Kits anzusehen.
4. Kompetitive Hemmungs-ELISA
Der Kompetitive Hemmungs-ELISA, auch bekannt als Blockierungs-ELISA, basiert hauptsächlich auf dem Prinzip, das zu detektierende Antigen oder Antikörper verwendet, um ein vorgedesigniertes System zu stören. Das endgültige Ergebnis der Farbentwicklung korreliert negativ mit dem Grad der Störung, die durch das zu detektierende Antigen oder Antikörper verursacht wird. Der Kompetitive Hemmungs-ELISA hat eine hohe Flexibilität, und komplexere experimentelle Protokolle können darauf basierend entwickelt werden, wodurch verschiedene spezielle ELISA-Methoden wie Direkter Kompettiver Hemmungs-ELISA, Indirekter Kompettiver Hemmungs-ELISA und Sandwich-Kompetitiver ELISA abgeleitet werden. Hier dienen nur der Direkte Kompettive Hemmungs-ELISA und der Indirekte Kompettive Hemmungs-ELISA als Beispiele zur kurzen Erläuterung des Prinzips.
Direkter Kompettiver Hemmungs-ELISA Das Antigen wird auf einen Festphasen-Träger vorgeschichtet, und enzym-markierte spezifische Antikörper werden hinzugefügt. Während des Experiments wird das zu detektierende Antigen oder Antikörper eingeführt. Wenn das Ziel zum Detektieren ein Antigen ist, konkurriert es mit dem vorgeschichteten Antigen auf dem Festphasen-Träger um die hinzugefügten enzym-markierten Antikörper. Wenn das Ziel zum Detektieren ein Antikörper ist, konkurriert es mit den hinzugefügten enzym-markierten Antikörpern, um an das auf einem Festphasen-Träger beschichtete Antigen zu binden. In beiden Fällen werden die während des Waschschritts ausgekonkurrierten enzym-markierten Antikörper ausgewaschen, wonach ein Substrat hinzugefügt wird, um die Farbentwicklung zu induzieren. Das Ergebnis der Farbentwicklung ist umgekehrt proportional zur Menge des zu detektierenden Antigens oder Antikörpers. Der direkte kompetitive Hemmungs-ELISA umfasst zwei Stufen der Signalverstärkung und hat daher eine relativ hohe Empfindlichkeit. Nach dem Vorbeschichten des Festphasen-Trägers und dem Hinzufügen der enzym-markierten Antikörper erfordert das Experiment nur das Verdünnen des zu detektierenden Antigens oder Antikörpers und dessen Hinzufügung zum System zur Reaktion, was den ELISA-Operationsprozess stark vereinfacht.
Indirekter Kompettiver Hemmungs-ELISA Das Antigen wird auf einen Festphasen-Träger vorgeschichtet, und ein spezifischer Antikörper sowie der entsprechende enzym-markierte sekundäre Antikörper gegen diesen Antikörper werden sequentiell hinzugefügt, um ein vorläufiges System zu bilden. Während des Experiments wird das verdünnte zu detektierende Antigen hinzugefügt, und das Antigen in der zu testenden Probe wird konkurrierend mit dem an den Festphasen-Träger gebundenen Antigen im vorläufigen System zur Bindung an den spezifischen Antikörper. Ähnlich kann die zu testende Probe auch ein Antikörper sein. Der indirekte kompetitive Hemmungs-ELISA hat eine höhere Detektionsempfindlichkeit, die vom Signalverstärkungseffekt vermittelt durch das enzym-markierte sekundäre Antikörper profitiert. Diese Methode erfordert nicht das Markieren des primären Antikörpers; stattdessen können kommerzielle enzym-markierte sekundäre Antikörper verwendet werden, um verschiedenen unterschiedlichen primären Antikörpern anzupassen, was zu einer stärkeren Vielseitigkeit führt. Gleichzeitig wird der Kosten- und technische Aufwand für den Antigen-Markierungsprozess effektiv reduziert. Diese Methode wird im neu eingeführten Produkt Lebensmittel-Sicherheitstest-Kit verwendet. Wenn Sie Bedürfnisse haben, können Sie uns kontaktieren. Besuchen Sie unsere Website, um ELISA-Kits anzusehen.
Zusätzlich zu den oben eingeführten grundlegenden ELISA-Typen können andere ELISA-Typen auch flexibel nach tatsächlichen Bedürfnissen entwickelt werden. Zum Beispiel kann Biotin-Avidin eingeführt werden, um den Verstärkungsfaktor des Systems zu erhöhen; ein anderes Beispiel ist, dass unlabeled sekundäre Antikörper, Protein A, Protein G usw. eingeführt werden können, um die Ladekapazität des Festphasen-Trägers zu erhöhen oder die Spezifität des Systems zu verbessern.
 | Felicia Felicia ist eine technische Unterstützungsspezialistin bei EnkiLife mit umfangreicher professioneller Erfahrung in der Antikörper-Entwicklung, Optimierung und ELISA-Assay-Gestaltung sowie -Anwendung. Sie widmet sich dem Assistentieren unserer Kunden beim Auswählen geeigneter Antikörperprodukte, der Optimierung von ELISA-experimentellen Protokollen und der Lösung technischer Herausforderungen, die im Prozess auftreten, wodurch sie den reibungslosen Fortschritt ihrer Life-Science-Forschungsprojekte unterstützt. |