HepG2-Zellen (Menschliche Leberkrebszellen) sind eine Zelllinie, die von einem 15-jährigen weißen männlichen Patienten mit Hepatozellulärem Karzinom abgeleitet wurde. Diese Zellen weisen epitheliale Morphologie und adhäsives Wachstumsverhalten auf. In vitro bilden sie bei der Kultivierung eng verbundene, kleininsulare Strukturen, die sich schichtförmig proliferieren, und besitzen eine hohe Proliferationsrate. Die HepG2-Zelllinie wird weit verbreitet in der Leberkrebsforschung, im Arzneimittelstoffwechsel sowie in der Toxizitätsbewertung eingesetzt und stellt ein wichtiges Instrument zur Erforschung von Leberfunktion und -erkrankungen dar.
HepG2-Zellen exprimieren verschiedene leberspezifische Proteine und Rezeptoren, wie z. B. Alpha-Fetoprotein (AFP), Albumin, Alpha-2-Makroglobulin, Insulinrezeptoren sowie IGF-II-Rezeptoren. Darüber hinaus exprimieren sie auch 3-Hydroxy-3-formyl-CoA-Reduktase und Hepatische Triglyceridlipase-Aktivität [2,3].
Für den Anzuchtprozess der HepG2-Zellen sind spezifische Bedingungen erforderlich, beispielsweise die Verwendung eines Kulturmediums mit 10 % fötales Kälberserum sowie hohe Anforderungen an pH-Wert und Serumeigenschaften des Mediums [3]. Diese Zellen werden typischerweise in einem Umfeld von 37 ℃, 95 % Luft und 5 % Kohlendioxid kultiviert.
Trotz vieler Vorteile der HepG2-Zellen, wie unbegrenzter Proliferation, stabilem Phänotyp und einfacher Handhabbarkeit, kann ihre metabolische Funktionsexpression geringer sein, weshalb sie in manchen metabolischen Studien möglicherweise nicht so gut als primäre Leberzellen agieren [1]. Dennoch bleiben HepG2-Zellen aufgrund ihres niedrigen Kostenprofils, ihrer einfachen Handhabung und Verfügbarkeit ein unverzichtbares Modell in der Leberkrebsforschung [1].
Zusammenfassend spielt die HepG2-Zelllinie eine wichtige Rolle in der Leberkrebsforschung. Ihre einzigartigen biologischen Eigenschaften und der breite Anwendungsbereich machen sie zu einem wichtigen Werkzeug für die Leberkrebsforschung.
Was ist der Ursprung und die historische Hintergründe der HepG2-Zelllinie?
Der Ursprung und die historische Hintergrundgeschichte der HepG2-Zelllinie lassen sich bis ins Jahr 1975 zurückverfolgen, als sie aus einer Lebertumorbiopsie eines 15-jährigen weißen argentinischen Jungen gewonnen wurde. Diese Tumorgewebe wurden zunächst als Hepatozelluläres Karzinom (HCC) beschrieben, doch spätere Forschungen ergaben, dass es sich tatsächlich um ein Hepatoblastom (HB) handelt [12]. Diese Fehlklassifizierung führte zu Verwirrung über 30 Jahre und wurde erst korrigiert, als Lopez Terrada et al. die Eigenschaften von HepG2 untersuchten [12].
Aufgrund ihrer einzigartigen funktionellen Merkmale wird die HepG2-Zelllinie in der wissenschaftlichen Forschung weit verbreitet eingesetzt, darunter die Synthese und Sekretion von Plasma-Proteinen, Cholesterin- und Triglyceridstoffwechsel, Lipoprotein-Stoffwechsel und Transport sowie Gallensäure-Synthese und Glykogenbildung [15]. Darüber hinaus wird sie in Bereichen wie Arzneimittelstoffwechsel, humaner Toxikologie, Krebsforschung, Leberkrankheiten, Genregulationsmechanismen und Biomarker-Entdeckung eingesetzt [14].
Obwohl die HepG2-Zelllinie viele Vorteile wie nahezu unbegrenzte Lebensdauer, stabiler Phänotyp, hohe Verfügbarkeit und einfache Bedienung bietet, weist sie auch einige Nachteile auf. Beispielsweise ist die Expression von Arzneimittelmetabolisierungsenzymen und -transportern begrenzt, und die Expressionshäufigkeit der meisten Arzneimittelmetabolisierung-CYP-Gene ist gering. Nach langjähriger Kultivierung können sich die Proteinexpressionsniveaus dieser Zelllinie verändern, was die Reproduzierbarkeit experimenteller Daten beeinträchtigen kann [15].
Welche spezifischen Anwendungsfälle haben HepG2-Zellen im Arzneimittelstoffwechsel und in der Toxizitätsbewertung?
Spezifische Anwendungsfälle von HepG2-Zellen im Arzneimittelstoffwechsel und in der Toxizitätsbewertung umfassen folgende Aspekte:
1. Arzneimittelmetabolismusforschung:
HepG2-Zellen mit erhöhter Expression von oCYP-Enzymen: Durch die Verwendung der Adenovirus-Vektorisierungstechnologie können HepG2-Zelle spezifische Cytochrom-P450 (CYP)-Enzyme wie CYP2C9, CYP3A4 usw. exprimieren, wodurch ihre Fähigkeit zur Untersuchung des Arzneimittelmetabolismus verbessert wird. So wurden in einer Studie HepG2-Zellen mit erhöhter CYP-Enzymexpression verwendet, um Veränderungen von Arzneimittelmetaboliten zu bewerten und Arzneimittelinteraktionen vorherzusagen [18].
Forschung von Arzneimittelmetabolismuswegen: HepG2-Zellen wurden verwendet, um spezifische metabolische Wege zu untersuchen, wie z. B. den Metabolismus von Ethylendiamin. Durch die Kontrolle der Methioninoxidation in der Zelllinie können die Rollen primärer und sekundärer metabolischer Enzyme in HepG2-Zellen abgeleitet werden [17].
2. Toxizitätsbewertung:
Arzneimittelinduzierte Leberschädigung (DILI): Durch die Verwendung von HepG2-Zellen, um einzelne oder mehrere CYP-Enzyme zu exprimieren, kombiniert mit einer Hochdurchsatz-Screening-(HCS)-Strategie, kann metabolieabhängige Arzneimitteltoxizität bewertet und susceptiblen metabolischen Phänotypen identifiziert werden. So zeigen Studien beispielsweise, dass HepG2-Zellen bei hoher Expression von CYP-Enzymen eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber biologisch aktivierten Arzneimitteln aufweisen [20].
Hepatotoxizitätstestung konventioneller Sedativa und Opioidarzneimittel: HepG2/C3A-Zelllinie, eine hochfunktionale abgeleitete HepG2-Klonzelllinie, kann verwendet werden, um die Hepatotoxizität konventioneller Sedativa und Opioidarzneimittel zu testen. Diese Zelllinien sind in der Lage, die meisten Plasma-Proteine zu synthetisieren und weisen hohe physiologische Reaktivität sowie metabolische Marker auf, wodurch sie wirksame Werkzeuge zur Vorhersage menschlicher Lebertoxizität darstellen [21].
Vorhersage von Arzneimittelinduzierter Leberschädigung:Durch die Behandlung von fünf hepatotoxischen Arzneimitteln in WT-HepG2-Zellen und CYPS-UGT1A1 KI-HepG2-Zellen wurde festgestellt, dass diese letztere empfindlicher auf Arzneimittelinduzierte Lebertoxizität reagiert, wodurch ihr Anwendungswert bei der Vorhersage von Arzneimittelinduzierter Leberschädigung bestätigt wird [18].
3. Weitere Anwendungen:
Forschung zu den Niveaus von Arzneimittelmetabolisierungsenzymen und deren Induktion: Die Effekte verschiedener Arzneimittel, wie z. B. Dimethylsulfoxid, Kamellienextrakt, Topiramat usw., auf HepG2-Zellen wurden untersucht sowie ihre Einflüsse auf Zellüberlebensrate, Mitochondrienfunktion und Glukosestoffwechsel [16].
Arzneimittelstoffwechsel- und Toxizitätscreening: HepG2-Zellen werden weit verbreitet für Arzneimittelstoffwechsel- und Toxizitätscreenings eingesetzt, insbesondere beim initialen Screening von Kandidatenarzneimitteln. So kann beispielsweise durch die Detektion der hemmenden Wirkung spezifischer Verbindungen auf CYP-spezifischen Substraten und Veränderungen zellulärer Aktivität die zeitabhängige Hemmung und Toxizität von Verbindungen bewertet werden [19].
Zusammenfassend haben HepG2-Zellen aufgrund ihrer Stabilität und einfachen Bedienung weite Anwendungsperspektiven im Arzneimittelstoffwechsel und in der Toxizitätsbewertung.
Welche spezifischen Unterschiede in der metabolischen Funktionsexpression bestehen zwischen HepG2-Zellen und primären Leberzellen?
Die Unterschiede in der metabolischen Funktionsexpression zwischen HepG2-Zellen und primären Leberzellen lassen sich hauptsächlich in folgenden Aspekten widerspiegeln:
1. Expression von Arzneimittelmetabolisierungsenzymen:
OCYP-Enzyme: Die Expressionsniveaus von Enzymen wie CYP3A4 in HepG2-Zellen sind deutlich niedriger als in primären Leberzellen, und diese Enzyme spielen eine Schlüsselrolle im Arzneimittelmetabolismus [12]. So beträgt die Expression von CYP3A4 in HepG2-Zellen nur 100-400-mal so viel wie in Leberzellen [12].
OUGT-Familienenzyme: Die Expression von UGT-Familienenzymen (wie z. B. UGT1A1, UGT1A4, UGT1A6, UGT2B7, UGT2B15 und GSTM1) in HepG2-Zellen ist entweder sehr niedrig oder vollständig fehlend, und diese Enzyme spielen eine Schlüsselrolle beim Metabolismus verschiedener Antikrebsmittel [12].
OSULT-Enzym: Es gab keinen signifikanten Unterschied in der Konzentration von SULT1A1 und SULT2A1 zwischen Leberzellen und HepG2-Zellen, jedoch sank das Niveau von SULT2A1 bei 50 % der HCC-Fälle [12].
2. Expression von Transporter-Proteinen:
Das Niveau des BSEP-Proteins in HepG2-Zellen beträgt nur 1/100 dessen in Leberzellen [12].
OMRP-Transporter: MRP4 wurde in HepG2-Zellen nicht detektiert, während die Niveaus von MRP3 und MRP6 nur 4-20-mal höher waren als in Leberzellen [12].
3. Genexpression und metabolische Wege:
Genexpressionsunterschiede: Viele genexpressionsbezogene Veränderungen im Zusammenhang mit Arzneimitteln und Fremdstoffmetabolismus in HepG2-Zellen können die Genauigkeit und Korrelation der Arzneimittelmetabolismusanalyse beeinflussen [22]. So sind beispielsweise die Expressionsniveaus von HSD17B6- und HSD17B13-Genen in Leberzelllinien niedriger als in primären Leberzellen [22].
Lipidstoffwechsel: Erhöhte Niveaus von Essigsäure, Kreatin, Isoleucin, Leucin und Phenylalanin in der HepG2-Zelllinie weisen auf Unterschiede im Lipidstoffwechsel hin [12].
4. Zelluläre Energiestoffwechsel:
HepG2-Zellen unterscheiden sich von primären Leberzellen in Bezug auf den zellulären Energiestoffwechsel. Beispielsweise reduzieren HepG2-Zellen die Cholesterinsekretion signifikant [23].
5. Weitere metabolische Funktionen:
OHepG2-Zellen behalten und verstärken systemische Veränderungen im Zusammenhang mit endogenen und exogenen Substanzmetabolismus, die denen bei Hepatoblastom- und Hepatozellulärem Karzinom-Zellen ähneln [12].
Wie optimiert man die Kulturbedingungen von HepG2-Zellen, um ihre metabolische Funktionsexpression zu verbessern?
Um die Kulturbedingungen von HepG2-Zellen zu optimieren und ihre metabolische Funktionsexpression zu verbessern, können folgende Punkte berücksichtigt werden:
1. Auswahl des Kulturmediums und Anpassung der Zusammensetzung:
Es ist gängige Praxis, DMEM oder RPMI-1640-Medium mit 10 % fötales Kälberserum (FKS) und 1 % Penicillin-Streptomycin zu verwenden [26,29,31]. Um den metabolischen Funktionsumfang weiter zu optimieren, kann man erwägen, spezifische Metabolismus-Regulatoren wie Glutamin und G418 hinzuzufügen [27].
2. Gasumgebung und Temperaturkontrolle:
Zellen sollten in einem feuchten Umfeld bei 37 ° C und 5 % CO2 kultiviert werden [26,31]. Darüber hinaus hat die Kontrolle von Hypoxie-Vorbehandlung und Reoxygenierungsphasen auch einen signifikanten Einfluss auf den metabolischen Funktionsumfang, was durch modulare Inkubatoren erreicht werden kann [27].
3. Dreidimensionale Kulturbedingungen:
Dreidimensionale Kulturbedingungen, wie z. B. die Verwendung von CVM-Kammern zur Kultur an flüssig-festem, flüssig-flüssigem und flüssig-gasförmigen Grenzflächen, können den Leberfunktionsumfang von HepG2-Zellen signifikant verbessern, einschließlich Albuminsekretion, Harnstoffsynthese und CYP3A4-Aktivitätsniveaus [34]. Darüber hinaus trägt die Optimierung des Anteils gemischter Hydrogele (wie PC4/Cultrex) auch zur Zellproliferation und Differenzierung bei [30].
4. Metabolitenbilanz und Messung:
Während des Kultivierungsprozesses kann das regelmäßige Messen der Konzentration extrazellulärer Metaboliten wie Glukose, Laktat, Aminosäuren usw. dazu beitragen, den metabolischen Zustand der Zellen zu verstehen und quantitative Analysen durch Methoden wie Hochdurchsatz-Flüssigchromatographie durchführen [28].
5. Genmodifikation und Arzneimittelbehandlung:
Genmodifikation von HepG2-Zellen, wie z. B. das Ausschalten oder Einfügen spezifischer Gene, kann ihre metabolische Funktion verbessern. So zeigten HepG2-Zellen, die TRET1-Sucrose-Transporter und AfrLEA2-Gen exprimieren, eine bessere Leistung in metabolischen Experimenten [27]. Darüber hinaus kann die Arzneimittelbehandlung, wie z. B. der Einsatz von Arzneimitteln wie Liraglutid, den zellulären metabolischen Funktionsumfang signifikant verbessern [24].
6. Zelldichte und Passagenbedingungen:
Die Passage-Kultur ist ein Routineverfahren, wenn die Zelldichte 80 % -90 % erreicht. Darüber hinaus kann durch die Anpassung der Inokulationsdichte und Kulturdauer, wie z. B. eine Inokulationsdichte von 7,5x10 ^ 3 Zellen/Well und eine Kulturdauer von 7-8 Tagen, hochwertige multidirektional differenzierte Zellen (MCTS) erhalten werden, wodurch die metabolische Funktion der Zellen verbessert wird [25].
Welche Limitierungen der HepG2-Zelllinie in der Leberkrebsforschung bestehen und wie können diese Limitationen überwunden werden?
Die HepG2-Zelllinie bietet ein breites Anwendungsspektrum in der Leberkrebsforschung, doch ihre Limitationen dürfen nicht ignoriert werden. Folgend sind die Hauptlimitierungen der HepG2-Zelllinie in der Leberkrebsforschung und deren Überwindungsmethoden:
limitierung
Im Vergleich zu normalen Leberzellen weisen HepG2-Zelllinien deutlich niedrigere Expressionsniveaus von Schlüsselmetabolisierungsenzymen der Leber auf und besitzen in der Regel eine geringere metabolische Kapazität [32]. Dies begrenzt die Fähigkeit der HepG2-Zelllinie, den Metabolismus und die Elimination hepatotoxischer Verbindungen vorherzusagen.
Es bestehen signifikante Unterschiede zwischen HepG2-Zelllinien und normalen Leberzellen, wie z. B. Veränderungen im P450-Gen. Darüber hinaus sind CTNNB1-Genmutationen in HepG2-Zelllinien mit einer hohen Inzidenz von Leberkrebs assoziiert, die bei normalen Leberzellen nicht häufig vorkommen [12].
Selbst Proben derselben Zelllinie zeigen signifikante Unterschiede, was möglicherweise auf Kreuzinfektion und Mykoplasma-Infektion zurückzuführen ist [12]. Diese Heterogenität begrenzt seinen prädiktiven Wert als Krebsmodell.
Die HepG2-Zelllinie weist eine unzureichende Expression von Schlüsselproteinen im Zusammenhang mit Substanzmetabolismus auf und fehlt an Absorptions-Transportern sowie ersten Phasen-Enzymen [12]. Dies deutet darauf hin, dass bei der Verwendung dieser Zelllinie zur Vorhersage des Metabolismus und der Elimination von Fremdstoffen in Leberzellen Vorsicht geboten ist.
HepG2-Zellen sind morphologisch den normalen Leberzellen ähnlich, jedoch sind ihre Mitochondrien und das endoplasmatische Retikulum schlecht entwickelt, reduziert in der Anzahl und strukturell abnormal [12]. Diese strukturellen Unterschiede können die Funktion und metabolische Aktivität der Zellen beeinflussen.
Überwindungsmethoden
Um das Problem der geringen metabolischen Kapazität in HepG2-Zelllinien zu überwinden, können andere Leberkrebszelllinien wie HepaRG betrachtet werden, die mehr Phasen-II-Metabolisierungsenzyme und höhere Membran-Transporter-Aktivität exprimieren [32].
Errichtung eines dreidimensionalen sphärischen Zellkultursystems verwandelt diese Methode Zellen in Kugelform, wodurch ein System entsteht, das näher am physiologischen System liegt. Die metabolische Aktivität des 3D-sphärischen HepG2-Modells, einschließlich Cytochromen, ist höher als bei zweidimensionalen Zellen und nähert sich normalen Leberzellen [12].
Durch die Anwendung von Geneditier-Techniken wie CRISPR-Cas9 zur Modifikation von HepG2-Zellen werden die Expressionsniveaus von Schlüsselmetabolisierungsenzymen erhöht, wodurch sie als Leberzellmodelle besser geeignet sind [12].
Kombination mehrerer Leberkrebszelllinien für die Forschung, um Verzerrungen durch eine einzelne Zelllinie zu reduzieren. So kann die Kombination der Forschungsresultate von HepG2 und anderen Leberkrebszelllinien (wie Huh7) umfassendere Datenunterstützung bieten [33].
Auf Basis von In-vitro-Experimenten wird die Wirksamkeit des Arzneimittels weiter in einem In-vivo-Modell validiert. So kann beispielsweise die Wirksamkeit von Kandidatenarzneimitteln in einem Maus-Leberkrebsmodell getestet werden, um die Zuverlässigkeit der In-vitro-experimentellen Ergebnisse zu gewährleisten [33].
Referenzen
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