Mitochondriales Membranpotential (MMP)

Einführung in das mitochondriale Membranpotential

Mitochondrien sind der Hauptort der ATP-Produktion in tierischen und pflanzlichen Zellen und stellen wichtige Organellen dar, die die zelluläre Energieumwandlung fördern und an der Zellapoptose teilnehmen. Mitochondrien speichern die während der respiratorischen Oxidation erzeugte Energie als elektrochemisches Potential im Inneren der mitochondrialen Membran, was zu einer asymmetrischen Verteilung von Protonenkonzentrationen auf beiden Seiten der Innenmembran führt und das mitochondriale Membranpotential (MMP, Δ PSI m) bildet. Ein normales MMP ist eine Voraussetzung für die Aufrechterhaltung der oxidativen Phosphorylierung in Mitochondrien und die Produktion von Adenosintriphosphat. Die Stabilität des MMPs ist vorteilhaft für die Aufrechterhaltung der normalen physiologischen Funktionen von Zellen.

Warum sollte man das mitochondriale Membranpotential messen?

Mitochondrien sind wichtige Regulatoren der zellulären Energie und des Stoffwechsels und spielen eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung von Zellwachstum und Überleben. Die Kernfunktion der Mitochondrien besteht in der Synthese von ATP durch oxidative Phosphorylierung, was in der mitochondrialen Bioenergetik gut bekannt ist. Die ATP-Produktion steht mit dem mitochondrialen Membranpotential in Verbindung. Mitochondrien halten die oxidative Phosphorylierung aufrecht und treiben die ATP-Synthese durch Potentialgradienten an, die von Elektronentransportketten generiert werden. Dieser Schritt wird durch einen Protonenpump auf der Innenmembran der Mitochondrien erreicht, der Protonen (H+) aus dem Matrixraum in den Zwischenmembranraum pumpt. Der transmembrane Transport von Protonen akkumuliert eine große Menge an Protonen im Zwischenmembranraum der Mitochondrien und bildet ein transmembranes Potential über die Innenmembran, das als mitochondriales Membranpotential bekannt ist. Wenn Protonen zurückkehren, treiben sie die ATP-Produktion, die wichtigste Energie-Währung in lebenden Organismen. 95% des ATP im menschlichen Körper werden von Mitochondrien bereitgestellt.

Unter normalen Bedingungen ist das Innenmembranpotential der Mitochondien hoch und bleibt bei einem negativen Potential, während das Außenmembranpotential niedrig und positiv bleibt. Wenn bestimmte Faktoren Hindernisse im Elektronentransferprozess der mitochondrialen Atmungskette verursachen, was die Bildung des Protonen (H+) transmembrans Gradienten in der Matrix beeinträchtigt, führt dies zu einer Abnahme des mitochondrialen Membranpotentials, also Depolarisation, was positiv außerhalb und negativ innerhalb ist. Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass die Abnahme des mitochondrialen Membranpotentials mit Autophagie, Apoptose oder Nekrose verbunden ist. Eine Dysfunktion des mitochondrialen Membranpotentials, selbst subtile abnormal Veränderungen, kann die biologische Aktivität von Zellen erheblich beeinträchtigen und verschiedene Krankheiten (Alzheimer-Krankheit, Diabetes, Krebs usw.) verursachen.

Daher ist das mitochondriale Membranpotential einer der wichtigen Indikatoren zur Bewertung der normalen Funktion von Mitochondrien. Es spiegelt nicht nur die Integrität der mitochondrialen Funktion wider, sondern hat auch wichtige Auswirkungen auf die Synthese von TP, Ionentransport, Regulation der Zellapoptose und antioxidative Aktivität. Gleichzeitig reflektiert es auch den Gesundheitszustand von Zellen und hat wichtige Bedeutung für ihr Überleben und ihre Entwicklung. Darüber hinaus ist das Detektieren von Veränderungen im mitochondrialen Membranpotential von großer Bedeutung für biologische Forschung und medizinische Diagnose. Daher sollten wir uns die Veränderungen des mitochondrialen Membranpotentials beachtet und entsprechende Maßnahmen ergreifen, um die normale Funktion der Mitochondrien zu schützen.

MMP-Detektionsmethoden

Heute repräsentieren Fluoreszenzproben den häufigsten Ansatz zur Bewertung mitochondrialer Funktionen durch Membranpotential-Assessment. Diese Proben – einschließlich JC-1, Rh123, TMRM, TMRE und DiOC6 – bestehen typischerweise aus lipophilen kationischen Verbindungen, die sich im mitochondrialen Matrixraum invers proportional zu ΔΨm ansammeln.

JC-1 Detektionsprinzip

JC-1-Farbstoff akkumuliert in Mitochondrien potential-abhängig und zeigt ein multicolor Fluoreszenzemissionsspektrum, was eine proportionale halbquantitative Bewertung der mitochondrialen Depolarisation ermöglicht. In normalen Mitochondien aggregieren JC-1 im mitochondrialen Matrixraum zu einem Polymer, das starke rote Fluoreszenz emittiert; Wenn Verbindungen die Kollabierung des mitochondrialen Membranpotentials induzieren, kann JC-1 nur als Monomer im Cytoplasma existieren aufgrund der Abnahme oder des Verlustes des Membranpotentials und emittiert grüne Fluoreszenz. Das bedeutet, dass in gesunden Zellen eine kleine Menge an grüner Fluoreszenz auftreten kann, wobei die Mehrheit rote Fluoreszenz aufweist; Die meisten Zellen mit Depolarisation von Mitochondrien zeigen nur grüne Fluoreszenz. Daher können Veränderungen im mitochondrialen Membranpotential durch Änderungen der Fluoreszenzfärbung reflektiert werden, oder das Ausmaß der mitochondrialen Depolarisation kann durch das Verhältnis von rot/grüner Fluoreszenzintensität gemessen werden.

Die Anregungswellenlänge des JC-1 Monomers ist 488 oder 514nm, emittiert grüne Fluoreszenz mit einer Wellenlänge von ungefähr 529nm; Die maximale Anregungswellenlänge des JC-1 Polymers ist 585nm, emittiert rote Fluoreszenz bei einer Wellenlänge von ungefähr 590nm. JC-1 kann detektiert werden unter Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie, Laser-Konfokalmikroskopie, Fluoreszenz-Spektrophotometer oder Flow-Cytometrie.

Experimentelles Verfahren

CCCP ist ein reversibler Protonengradienten-Entkopplungsagent, das den elektrochemischen Potentialunterschied über die mitochondriale Membran schnell reduzieren kann und zu einer schnellen Depolarisation von intrazellulären Mitochondrien führt. Daher können Zellen, die mit CCCP behandelt wurden, als positive Kontrollen für JC-1-Detektion verwendet werden. Nach CCCP-Behandlung wird das mitochondriale Membranpotential vollständig verloren sein, und JC-1-Färbung zeigt grüne Fluoreszenz an, während normale Zellen nach JC-1-Färbung rote Fluoreszenz zeigen sollten.

1. Zellfärbung

1.1 Suspensierte Zellen

(1) Zellplattierung: Nehmen Sie eine 6-Well-Platte als Beispiel, resuspendieren Sie 1 Million Zellen in 1mL Kulturmedium pro Well und wiederholen Sie denselben Prozess für andere Kulturgefäße. Sie können auch die passende Dichte für das Plattieren nach Ihrem Zelltyp wählen.

(2) Positive Kontrolle einrichten: Nehmen Sie eine angemessene Menge an CCCP um Zellen zu behandeln und inkubieren Sie sie in einem Zellkultur-Inkubator bei 37 ℃ für 5 Minuten.

(3) JC-1 Färbung: Fügen Sie eine angemessene Menge an JC-1 hinzu und inkubieren in einem Zellkultur-Inkubator bei 37 ℃ für 15 Minuten. Im Allgemeinen sind 15 Minuten ausreichend für ausreichende Färbung.

(4) Zentrifugieren: Nach Inkubation bei 37 ℃ zentrifugieren Sie 400g bei 4 ℃ für 3-4 Minuten, verwerfen das Supernatant und seien Sie vorsichtig so viel wie möglich Zell sediment nicht zu entfernen.

(5) Waschen: Waschen Sie zweimal mit 1 × PBS, zentrifugieren Sie 400g bei 4 ℃ für 3-4 Minuten.

(6) Ergebnisdetektion: Resuspendieren Sie die Zellen in 500 μ L PBS und beobachten Sie sie unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops oder Laser-Konfokalmikroskop, oder analysieren Sie sie mit einem Fluoreszenz-Spektrophotometer oder Flow-Cytometer (grüne Fluoreszenz: Ex/Im=510/527nm; Rote Fluoreszenz: Ex/Im=585/590nm).

1.2 Adhärente Zellen

Wenn Sie ein Fluoreszenz-Spektrophotometer oder Flow-Cytometer verwenden, um adhärente Zellen zu detektieren, können die adhärenten Zellen zuerst verdaut und gesammelt werden, resuspendiert und dann kann das Detektionsverfahren für suspendierte Zellen herangezogen werden. Wenn Sie ein Fluoreszenzmikroskop oder Laser-Konfokalmikroskop zur Detektion verwenden: beziehen Sie sich einfach auf die Schritte und Methoden des Suspensionszells-Experiments.

Vorsichtsmaßnahmen

Referenzen