Die folgenden Überlegungen sind hilfreich bei der Auswahl von Sekundärantikörpern:

1. Ermitteln Sie die Art des Primärantikörpers (z. B. das Spezies, gegen das der Primärantikörper gerichtet ist; z. B. bei einem Kaninchen-Anti-MS2 monoklonalen Antikörper ist die Art des Primärantikörpers Kaninchen).

2. Wählen Sie eine geeignete Art für den Sekundärantikörper (z. B. Ziegen-Anti-Maus IgG, bei dem der Sekundärantikörper aus Ziege stammt).

3. Berücksichtigen Sie die Kreuzreaktivität oder Spezifität des Sekundärantikörpers und prüfen Sie, ob er kreuzadsorbiert wurde.
4. Überlegen Sie, ob er für Multiplex-Markierungsanwendungen verwendet werden soll oder ob das Probenmaterial endogene Antikörper enthält.
5. Spezifität: Stellen Sie sicher, dass er korrekt an die Klasse oder das Fragment des Primärantikörpers bindet.
6. Wählen Sie den geeigneten Konjugat basierend auf der Nachweismethode.

Sekundärantikörper werden gegen das Spezies des Primärantikörpers erzeugt. Daher benötigen Sie einen Sekundärantikörper, der in einer Art erzeugt wurde, die sich von der Art Ihres Primärantikörpers unterscheidet. Zum Beispiel, wenn Ihr Primärantikörper aus Kaninchen stammt, benötigen Sie einen Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper, der in einem nicht-Kaninchenspezifischen Wirtsorganismus (z. B. Ziege, Maus etc.) erzeugt wurde.

Einige unserer empfohlenen Antikörperverdünnungen/-konzentrationen stammen aus Experimenten während der Antikörperentwicklung oder basieren auf den Erfahrungen unserer Partner und anderer Kunden. Aufgrund von Unterschieden in Proben oder experimentellen Bedingungen können sie in Ihrem spezifischen Experiment nicht optimal funktionieren. Wenn unsere Empfehlung für Sie nicht funktioniert, versuchen Sie bitte mehrere verschiedene Verdünnungen/Konzentrationen.

Ziegen-Anti-Maus IgG (H+L) ist in verschiedenen Qualitäten erhältlich und es gibt eine gewisse Sequenzähnlichkeit zwischen IgG- und IgM-Antikörpern. Daher kann Ziegen-Anti-Maus IgG (H+L), das nicht kreuzadsorbiert wurde, einige Kreuzreaktivität mit Maus-IgM-Antikörpern aufweisen. Wenn ein vollständiger Mangel an Kreuzreaktivität mit IgM-Antikörpern erforderlich ist, können Sie Antikörper wie Ziegen-Anti-Maus IgG1, Ziegen-Anti-Maus IgG2a, Ziegen-Anti-Maus IgG2b etc. wählen.

Ziegen-Anti-Maus IgG (H+L) wird an alle Untergruppen von Maus-IgG binden, einschließlich IgG3.

Dieser Antikörper wurde nicht gegen Ratte-IgG kreuzadsorbiert und wir verfügen über keine umfassenden Informationen dazu. Allerdings, da der betreffende Antikörper polyklonal ist, kann diese Möglichkeit nicht ausgeschlossen werden.

Das Immunogen für Ziegen-Anti-Maus IgG (H+L) umfasst sowohl schwere als auch leichte Ketten. Die Leichtkette kann entweder Kappa oder Lambda sein. Daher wird dieser Antikörper mit Primärantikörpern reagieren, die Kappa-Ketten tragen, aber er ist nicht ausschließlich spezifisch für die Kappa-Kette.

Ein Antikörper, der mit zwei verschiedenen Konjugaten markiert ist, ermöglicht sowohl chromogenes als auch fluoreszierendes Bildgebung desselben Probens. Daher sind multimodale Studien möglich und wir können eine individuelle Markierung zu diesem Zweck bereitstellen.

Sekundärantikörper binden an Primärantikörper. Daher hängt das Anwendungsspektrum eines Sekundärantikörpers enger mit dem Primärantikörper zusammen. Wenn ein Primärantikörper für bestimmte Immunoassays verwendet werden kann, kann der Sekundärantikörper in der Regel ebenfalls verwendet werden. Folglich hängt das finale Anwendungsspektrum primär vom Anwendungsbereich des Primärantikörpers, der Art des Sekundärantikörpermarkierung und dem Signaloutput-System ab.

Alle Fluorophore werden bei Exposition gegenüber intensivem Licht in ihrem Absorptionswellenlänge bis zu einem gewissen Grad verblassen oder untergehen "Photobleaching". Mögliche Lösungen umfassen:

1. Wählen Sie photostabile Farbstoffe, wie Fluor-Farben.
2. Stellen Sie flexibel den Gegenfärbung und den Bildausschnitt ein, wechseln dann zum Ziel-Farbe für die Bildgebung.
3. Verringern Sie die Belichtungszeit und Intensität, z. B. durch Verringerung der Laserleistung oder Verwendung von Neutraldichte-Filtern.
4. Halten Sie die Beobachtungszeit markierter Proben so kurz wie möglich und schließen den Verschluss beim Nicht-Ansehen.
5. Verwenden Sie Objektive mit niedrigerer numerischer Öffnung, z. B. Niedrigleistungs-Objektiven.

Das klassische ELISA-System verwendet oft ein Sandwich-Assay-Format, das eine Capture-Antikörper und einen Detektionsantikörper beinhaltet. Wenn beide Antikörper Maus-monoklonale Antikörper sind, würde das HRP-markierte Ziegen-Anti-Maus IgG an beiden binden, wodurch der Assay unspezifisch wird. Daher muss in einem ELISA-System die Art des Capture-Antikörpers nicht Maus sein, während der Detektionsantikörper maus-abgeleitet sein muss. Zusätzlich sollte die Probenart, die nachgewiesen werden soll, kein Maus-IgG oder ähnliche Moleküle enthalten.

Die Verwendung von Sekundärantikörpern, die mit verschiedenen Fluorophoren konjugiert wurden, für multicolor-Immunfluoreszenz ist machbar, erfordert aber sorgfältige Planung und Überlegung:

1. Auswahl der Fluorophore: Wählen Sie Fluorophore, deren Anregungs- und Emissionsspektren so getrennt sind wie möglich. Weniger spektrale Überlappung reduziert die Möglichkeit von Crosstalk (Bleed-through). Bevorzugen Sie Farbkombinationen mit weit entfernten Emissionspeaks (z. B. ist die Kombination von Fluor488, Fluor555 und Fluor647 sehr klassisch).
2. Instrument-Kompatibilität: Stellen Sie sicher, dass das gewählte Fluorphor effektiv durch die Laser und Filtersets des Mikroskops oder Bildgebungssystems Ihres Labors angeregt und detektiert werden kann. Konsultieren Sie das Instrument-Konfigurations-Manual vor der Auswahl von Farbstoffen.
3. Anpassung von Helligkeit und Expressionsniveau: Zuweisen Sie die hellsten Fluorophore (z. B. Fluor647, Cy5) zu niedrig-abundanten Zielproteinen. Zuweisen Sie schwächere Fluorophore (z. B. FITC, Cy2) zu hoch-abundanten Zielproteinen. Dies hilft, Signalintensitäten über Kanäle hinweg auszubalancieren und verhindert, dass starke Signale schwache Signale verdecken.
4. Sekundärantikörper-Spezifität und Kreuzadsorption: Dies ist entscheidend, um unspezifische Kreuzreaktivität zu vermeiden und direkt die Ergebniszuverlässigkeit beeinflusst. Sie müssen Sekundärantikörper auswählen, die kreuzadsorbiert wurden. Dies bedeutet, dass der Antikörper gereinigt wurde, um Antikörper zu entfernen, die möglicherweise mit Immunglobulinen aus anderen Spezies reagieren könnten. Zum Beispiel, wenn Sie sowohl Maus- als auch Ratte-Primärantikörper verwenden, sollte Ihr Anti-Maus-Sekundärantikörper kreuzadsorbiert gegen Ratte-Serumproteine sein und umgekehrt. Dies stellt sicher, dass der Sekundärantikörper nur an seinem spezifischen Ziel-Primärantikörper bindet und nicht mit Primärantikörpern aus anderen Spezies reagiert.
5. Wirtsart: Alle Sekundärantikörper sollten von derselben Wirtsart abgeleitet sein (z. B. alle ziegen-abgeleitete). Dies verhindert, dass Sekundärantikörper erkennen und aneinander binden (z. B. ein Anti-Kaninchen-Sekundär zufällig bindet an ein Anti-Maus-Sekundär), was zu falschen Positiven führen würde.
6. Experimentelles Design und Kontrollen: Ohne geeignete Kontrollen können multicolor-Ergebnisse schwer interpretiert werden. Einzel-Färb-Kontrollen sind wesentlich. Für jedes Experiment sollten Proben enthalten, die nur mit einem Primär/Sekundär-Antikörper-Paar gefärbt wurden, während andere Kanäle nur Sekundärantikörper-Lösungsmittel (oder kein Primär) erhalten. Nutzen Sie diese Kontrollen, um Crosstalk in jedem Kanal unter Ihren tatsächlichen Bildaufnahme-Einstellungen zu überprüfen. Blank-Kontrolle: Lassen Sie alle Primärantikörper aus, inkubieren nur mit der Sekundärantikörper-Mischung, um unspezifische Bindung der Secondaries zu erkennen. Sequenzielle Inkubation: Es wird empfohlen, Primärantikörper aus verschiedenen Spezies separat zuerst zu inkubieren, dann die entsprechenden art-spezifischen Sekundärantikörper als Mischung zu inkubieren. Dies kann das Risiko von Kreuzreaktionen im Vergleich zum Mischen aller Primären und dann aller Secondaries reduzieren.
7. Antikörper-Konzentration-Optimierung (Titrierung): Titrieren Sie jedes Antikörper-Paar immer vor der Verwendung, um die optimale Konzentration zu finden, die das höchste Signal-zu-Rausch-Verhältnis gibt. Übermäßig hohe Antikörperkonzentrationen erhöhen Hintergrund und unspezifische Bindung.
8. Bildaufnahme und -verarbeitung: Auch bei einem gut durchgeführten Experiment kann unangemessene Bildaufnahme die Ergebnisse ruinieren. Vermeiden Sie gleichzeitige Anregung und Aufnahme aller Kanäle. Stellen Sie die Aufnahmereihenfolge ein, um jeden Kanal separat anzuregen und aufzunehmen (sequenziell). Dies eliminiert vollständig Crosstalk zwischen Kanälen während der Aufnahme. Spektrale Unmischung: Wenn Ihr Instrument diese Fähigkeit hat (z. B. einige konfokale Mikroskope), kann es fluoreszierende Signale mit hoch überlappenden Spektren effektiv trennen und ist ein leistungsstarkes Werkzeug für multicolor-Experimente. Post-Processing: Wenn geringfügiges Crosstalk detektiert wird, kann Software manchmal zur spektralen Unmischungs-Berechnung verwendet werden, aber der beste Ansatz besteht darin, Crosstalk während des experimentellen Design-Stadiums zu vermeiden.