Häufig gestellte Fragen zu Labeling Kits
F1:Welche Arten von Antikörpern oder Proteinen können mit kleinen Molekül-Färbemitteln-Labeling Kits markiert werden?
A:Konventionelle IgG-Antikörper aus verschiedenen Spezies können markiert werden. IgM-Antikörper können ebenfalls mit entsprechenden Anpassungen der Färbemittel-Dosis oder des Labeling-Puffers markiert werden. Andere Antikörpertypen wie IgY, IgD und IgA wurden nicht validiert, können jedoch theoretisch markiert werden, solange freie primäre Aminogruppen am Antikörper oder Protein vorhanden sind.
F2: Welche Überlegungen sind für das zu markierende Material erforderlich?
A:Das zu markierende Material muss freie primäre Amine oder N-Termini besitzen. Die Probe sollte keinen Tris, Glycerol, Proteine oder Reagenzien mit Aminogruppen enthalten.
F3: Können kleine oder Spur Mengen an Markierung durchgeführt werden (z. B. weniger als 10 μg Antikörperprotein)?
A:Die derzeitige Methode im Handbuch dient der Markierung von 0,02-2 mg Antikörperprotein. Für kleinere Mengen können wir Anpassungen oder Labeling-Dienste anbieten. In Zukunft werden wir auch ein Kit für die Markierung von weniger als 10 μg Antikörperprotein herausgeben.
F4: Kann eine bestimmte Substanz (z. B. Folsäure/Peptid) mit FITC/Fluor594 unter Verwendung des Labeling Kits markiert werden?
A:Wenn eine Substanz freie primäre Aminogruppen besitzt, kann sie theoretisch markiert werden. Bei Proteinen sollte die Anzahl der primären Amine (Lysin) berücksichtigt werden. Bei kleinen Molekülen bestimmt die Anzahl der Amine die Markierung. Folsäure hat eine Aminogruppe auf ihrem stickstoffhaltigen Heterocyclus, was eine theoretische Markierung mit FITC oder Fluor594 ermöglicht. Allerdings ist die Nucleophilie dieser Aminogruppe relativ schwach, und die Labeling-Effizienz könnte nicht gut sein. Zusätzlich sollte die Größe des markierten Materials dem geeigneten Ultrafiltrationsröhrchen für die Reinigung entsprechen, was der Kunde basierend auf seinem experimentellen Zweck entscheiden muss.
F5: Wie verbessert man die Labeling-Effizienz (DOL) von Biotin/Kleinstmolekül-Fluoreszenzfarbstoffen?
A: Es gibt viele Wege, dies zu versuchen.
1) Das Verhältnis von Farbstoff zu Protein in der Reaktion erhöhen.
2) Die Protein-Konzentration im Reaktionsystem erhöhen.
3) Die Reaktions temperatur und -zeit angemessen erhöhen.
4) Das Labeling-Puffer für das Zielprotein ändern.
F6: Führt eine höhere Labeling-Effizienz immer zu besseren experimentellen Ergebnissen?
A:Nein. Allgemein ist für konventionelle IgG-Antikörper ein DOL zwischen 2 und 9 angemessener. Wenn das DOL diesen Bereich überschreitet, verschlechtern sich die experimentellen Ergebnisse in der Regel. Die spezifischen experimentellen Ergebnissen hängen von den Eigenschaften des zu markierenden Proteins und Antikörpers ab, und das optimale DOL sollte basierend auf tatsächlichen experimentellen Ergebnissen bestimmt werden.
F7: Wie quantifiziert man und bestimmt die Konzentration rekombinanter Proteine nach der Markierung mit Kleinstmolekül-Farbstoffen?
A:Es gibt verschiedene Methoden zur Quantifizierung rekombinanter Proteine, wie z. B. BCA-Methode, UV-Absorptionsmethode, Bradford, Coomassie Brilliant Blue, Lowry-Methode usw., um die Protein-Konzentration zu messen. Alternativ kann die Absorption entsprechend dem Handbuch gemessen werden, um die Konzentration zu berechnen. Jede Methode hat ihre Einschränkungen, und Kunden können das geeignete Messschema basierend auf ihrer tatsächlichen Situation wählen.
F8: Können Biotin-Labeling Kits verwendet werden, um andere Proteine außer Antikörpern zu markieren?
A:Das Prinzip der Biotin-Labeling Kits ist, dass die Esterbindung von aktiviertem Biotin mit der Aminogruppe am Zielmaterial reagiert und eine stabile Amidbindung bildet. Zusätzlich kann das N-Terminus von Proteinen markiert werden. Wenn ein Protein primäre Amine wie Lysin besitzt, kann es markiert werden.
F9: Ist das Reaktionsverhältnis für die Protein-Markierung mit dem Biotin-Labeling Kit 20:1?
A:Das Molekulargewicht des Proteins und die Anzahl der Lysine, die es trägt, sollten berücksichtigt werden. Allgemein wird empfohlen, mit einer Konzentration von 1–5 mg/mL zu markieren. Wenn die Anzahl der Lysine bei etwa 10–15 liegt, kann ein Verhältnis von 1:20 verwendet werden. Wenn mehr Lysine vorhanden sind, sollte das Verhältnis angepasst werden.
F10: Wie wird die Effizienz von Biotin-markierten Antikörpern detektiert?
A: Die von uns angebotenen Biotin-Labeling Kits wurden für das Markierungsverhältnis zahlreicher Antikörper optimiert. Wenn man die Wiederfindungsrate der markierten Antikörper betrachtet, liegt diese typischerweise über 80%. Je größer die Menge an markiertem Antikörper ist, desto höher ist die Wiederfindungsrate. Es ist wichtig zu beachten, dass die Berechnungsmethode für Biotin-Labeling-Effizienz zwischen Herstellern unterschiedlich sein kann und nicht das alleinige Kriterium zur Bewertung des Labeling-Erfolgs sein sollte.
F11: Wie lange ist die Haltbarkeit von gelöstem aktiviertem Biotin/Kleinstmolekül-Fluoreszenzfarbstoffen?
A:Das Trockenpulver von aktiviertem Biotin/Kleinstmolekül-Fluoreszenzfarbstoffen kann vor dem Öffnen über ein Jahr bei -20°C aufbewahrt werden. Nach dem Öffnen/Lösen sollte es jedoch gut verschlossen, vor Licht und Feuchtigkeit geschützt und innerhalb einer Woche verwendet werden.
F12: Sind die mit Biotin oder Kleinstmolekülen markierten Proteine steril, und wie sterilisiert oder desinfiziert man sie?
A:Der Labeling-Prozess erfolgt normalerweise in einer offenen Fläche, so dass das markierte Protein nicht vollständig steril sein wird. Methoden für Sterilisation oder Desinfektion umfassen:
Für kleine Volumina (z. B. 50–500 μL) an markiertem Protein kann Vakuum-Freeze-Drying für die initiale Sterilisation verwendet werden, oder Hochgeschwindigkeits-Zentrifugation kann verwendet werden, um Bakterien zu fälligen und das Supernatant zu entnehmen, um die meisten Bakterien zu entfernen.
Für größere Volumina (größer als 1 ml) an markiertem Protein kann ein nadelartiger steriler Filter für Filtration und Sterilisation verwendet werden.
F13: Wie detektiert und berechnet man die Effizienz der Protein-Markierung mit Biotin/Kleinstmolekül-Farbstoffen?
A:Es gibt verschiedene Möglichkeiten, die Berechnung der Labeling-Effizienz zu verstehen:
1)DOL: Die durchschnittliche Anzahl der Farbstoffe, die pro Protein markiert sind. Je höher das DOL, desto höher ist die Labeling-Effizienz.
2)Das Verhältnis von DOL zum Feed-Verhältnis. Zum Beispiel, wenn das Feed-Verhältnis von Farbstoff zu Protein 10 ist und das finale DOL 5 beträgt, dann ist die Labeling-Effizienz 50%.
3)Antikörper-Wiederfindungsrate: Messe die Menge an Antikörper vor und nach der Markierung. Je weniger Antikörperverlust nach der Markierung, desto höher ist die Wiederfindungsrate und Labeling-Effizienz.
F14: Wie lange können markierte Antikörper bei 4°Caufbewahrt werden?
A:Markierte Antikörper, die in unserem Labeling-Preservation-Lösungsmittel gelagert werden, können über ein halbes Jahr bei 4°Cstabil aufbewahrt werden. Antikörper, die mit Kleinstmolekülen markiert wurden, können über ein Jahr stabil aufbewahrt werden.
F15: Gibt es Anforderungen an die Größe der markierten Antikörper oder Proteine?
A:Die derzeit verfügbaren Labeling Kits schlagen vor, Antikörper oder Proteine von etwa 150 kDa zu markieren. Wenn Kunden Proteine anderer Größen markieren müssen, können wir den Prozess anpassen und anpassen. Allgemein sollte die vorgeschlagene Protein-Größe jedoch nicht weniger als 20 kDa sein.
F16: Gibt es Antikörper, die für die Markierung nicht geeignet sind?
A:Antikörper oder Proteine, die Rinder-Serum-Albumin (BSA), Gelatine, freie Aminosäuren oder Ammoniumsalze enthalten, sind für die Markierung nicht geeignet.
F17: Wie viele Fluorophore können im Allgemeinen an einen Antikörper binden? Werden verschiedene Antikörper unterschiedliche Zahlen von markierten Fluorophoren haben?
A: Für denselben Fluorophore sind unter identischen Labeling-Bedingungen die Anzahl der markierten Fluorophore auf verschiedenen Antikörpern relativ klein, es sei denn, es gibt wesentliche Unterschiede in der Antikörper-Quelle oder Pufferzusammensetzung. Typischerweise kann ein Antikörper mit 2 bis 9 Fluorophoren markiert werden. Sobald das Degree of Labeling (DOL) 5 überschreitet, wird die Zunahme der Helligkeit unbedeutend, obwohl der Hintergrundwert steigen könnte. Für Fluorophore, die gegen Quenching resistent sind, können bis zu 9 angebracht werden. In außergewöhnlichen Fällen können bestimmte spezialisierte Antikörper in Kombination mit spezifischen Fluorophoren mehr als 10 oder sogar nur 2 erreichen und dabei noch immer eine gute Fluoreszenzintensität aufrechterhalten.
F18: Wie wird die Labeling-Effizienz DOL detektiert und berechnet?
A:Wir messen das molare Verhältnis von gereinigtem Farbstoff/Antikörper-Protein. Es gibt auch Methoden unter Verwendung von SDS-PAGE- Elektrophorese oder SEC-Reinigungssäulen für die Bestimmung. Die Ergebnisse aus verschiedenen Methoden können leicht variieren, aber im Allgemeinen sind die Unterschiede nicht signifikant.
F19: Warum ist die Fluoreszenz nach der Markierung mit EnkiLife Labeling Kits normalerweise heller?
A:Die Fluoreszenzfarbstoffe, die in unseren Labeling Kits verwendet werden, wurden von mehreren Fluoreszenzfarbstoff-Rohstoff-Lieferanten ausgewählt und haben strenge Qualitätsprüfungen undergone. Zusätzlich wurden einige Farbstoff-Rohstoffe chemisch behandelt, um ihre Stabilität aufrechtzuerhalten.
F20: Was ist das allgemeine Verhältnis von Kleinstmolekül-Fluoreszenzfarbstoffen/Biotin zu Protein?
A:Wenn die Antikörper-Konzentration 1 mg/ml beträgt, ist das molare Verhältnis etwa 1:20. Es kann einige Unterschiede für verschiedene Fluoreszenzfarbstoffe/Biotin geben, aber es liegt im Allgemeinen zwischen 10:1 und 30:1.
F21: Ist das Prinzip der Markierung von Antikörpern mit Kleinstmolekül-Fluoreszenzfarbstoffen/Biotin dasselbe wie bei großen Molekülen Protein-Fluoreszenzfarbstoffen, und was sind die Unterschiede?
A: Kleinstmolekül-Fluoreszenzfarbstoffe und Biotin nutzen SE (succinimidyl ester NHS), um mit den -NH2-Gruppen von Antikörpern zu verknüpfen, wodurch eine Struktur entsteht, die einer Peptidbindung ähnelt. Dies ist die einfachste Methode der Verknüpfung. Im Gegensatz dazu verwenden große Moleküle Protein-Fluoreszenzfarbstoffe die Maleimide-Aktivgruppe, um mit Thiol (-SH)-Gruppen zu binden. Der Vorteil dieser Methode besteht darin, dass sie spezifisch den Fc-Fragment des Antikörpers markiert und das Antigen unberührt lässt.
F22: Kann ich das Antikörper-Labeling Kit verwenden, wenn mein Antikörper Glycerol enthält?
A: Es ist am besten, wenn der Glycerol-Gehalt unter 20% liegt. Wenn der Glycerol-Gehalt höher ist, kann er durch Verwendung eines Ultrafiltrationsröhrchens für mehrere Runden von Puffer-Austausch reduziert werden. Dies könnte jedoch die Wiederfindungsrate des Antikörpers beeinträchtigen.
F23: Kann ich das Antikörper-Labeling Kit verwenden, wenn mein Antikörper BSA enthält?
A: Für große Moleküle Protein-Fluoreszenzfarbstoff-Labeling Kits ist eine kleine Menge BSA (unter 0,2%) zulässig. Für Kleinstmolekül-Fluoreszenzfarbstoff/Biotin-Labeling Kits kann das Vorhandensein von BSA die Labeling-Ergebnisse signifikant beeinflussen. Wir bieten ein BSA-Entfernungs-Kit für Antikörper an, das verwendet werden kann, um BSA vor der Markierung zu entfernen und bessere Ergebnisse zu erzielen.
F24: Warum erfordert Ihr Kit so viele Ultrafiltrationsschritte? Ich sehe, dass die Labeling-Prozeduren anderer Hersteller viel einfacher sind.
A: Um optimale Labeling-Ergebnisse zu gewährleisten, verarbeiten unsere Labeling Kits normalerweise das Antikörper-Rohmaterial, um Verunreinigungen zu eliminieren, die den Labeling-Prozess stören könnten. Nach der Markierung integrieren bestimmte Kits einen Reinigungsschritt, um den Einfluss von unverarbeitetem Farbstoff auf nachfolgende Detektionsergebnisse weiter zu minimieren, z. B. zur Reduzierung von Hintergrund-Färbung oder für in-vivo-Anwendungen. Wenn das Antikörper des Kunden keine störenden Faktoren hat und die geeignete Konzentration besitzt, können einige Schritte vereinfacht werden. Die gesamte Zeit, die für das Labeling erforderlich ist, unterscheidet sich nicht merklich von der anderer Hersteller.
F25: Wie sollte ich ein Labeling Kit wählen, wenn ich mehr als 10 mg Antikörper markieren muss?
A: Da großangelegte und kleinstangelegte Labeling-Prozesse unterschiedlich sind, bieten wir derzeit kein spezifisches Labeling Kit für 10 mg Antikörper an. Wenn die 10 mg Antikörper vom gleichen Typ sind, können Sie sich für zehn 1 mg Kits entscheiden oder unseren Labeling-Dienst in Betracht ziehen. Sollten die 10 mg Antikörper aus verschiedenen Arten bestehen, können Sie basierend auf der erforderlichen Fluoreszenz-Art und den Markierungskosten auswählen.
 | Hansun Hansun ist ein Protein-Labeling-Experte bei EnkiLife, der in Immunologie, Labeling-Techniken und Flusszytometrie bewandert ist und sich auf präzises Protein-Labeling und die Stärkung technologischer Durchbrüche spezialisiert hat. Jedes Protein verdient es, 'gesehen' zu werden. |