I. Probenvorlauf (Sample Lysis)

Präparation des Zellkultur-Lysats aus haftenbleibenden Zellen

1. Zellkultur-Schalen auf Eis legen und Zellen mit kaltem PBS waschen.
2. PBS entfernen und kalten Lysierungspuffer hinzufügen (1 mL pro 10⁷ Zellen/100 mm Schale).
3. Ein vorab gekühlter Kunststoff-Zellkratzer verwenden, um haftenbleibende Zellen aus der Schale zu kratzen. Übertragen Sie die Zellsuspension vorsichtig in ein vorab gekühltes Zentrifugier-Röhrchen. Alternativ können Zellen mit Trypsin verdaut werden, mit PBS gewaschen und in Lysierungspuffer im Zentrifugier-Röhrchen resuspendiert werden.
4. Ununterbrochen bei 4 °C für 30 Minuten schütteln.
5. Zentrifugieren bei 12.000 U/min für 5 Minuten bei 4 °C.
6. Vorsichtig das Zentrifugier-Röhrchen aus der Zentrifuge entnehmen und auf Eis legen. Übertragen Sie das Überstand in ein neues vorab gekühltes Röhrchen auf Eis.

Präparation des Zellkultur-Lysats aus schwebenden Zellen

1. Schwebende Zellen bei 300 g für 5 Minuten zentrifugieren, das Überstand verwerfen und Zellen in 10 mL kaltem PBS resuspendieren. Nochmals zentrifugieren und PBS verwerfen.
2. Zellen im Rest-PBS resuspendieren und kalten Lysierungspuffer hinzufügen (1 mL pro 10⁷ Zellen/100 mm Schale). Ununterbrochen bei 4 °C für 30 Minuten schütteln.
3. Zentrifugieren bei 12.000 U/min für 5 Minuten bei 4 °C.
4. Vorsichtig das Zentrifugier-Röhrchen aus der Zentrifuge entnehmen und auf Eis legen. Übertragen Sie das Überstand in ein neues vorab gekühltes Röhrchen auf Eis.

Präparation des Gewebs-Lysats

1. Zielgewebe so schnell wie möglich mit sauberen Instrumenten auf Eis ausschneiden, um Proteolyse zu verhindern.
2. Gewebe in ein Mörser geben, flüssigen Stickstoff eingießen zum „Flash Freeze“ und sofort homogenisieren. Lysierungspuffer hinzufügen und ununterbrochen bei 4 °C für 2 Stunden schütteln. Das Volumen des Lysierungspfuffers sollte basierend auf der Gesamtgewebsmenge bestimmt werden. Der Proteinextrakt sollte nicht zu stark verdünnt sein, um Proteinvverlust zu vermeiden. Minimieren Sie das Probenvolumen für Gel-Loading. Die Mindestkonzentration beträgt 0,1 mg/mL und die optimale Konzentration liegt zwischen 1-5 mg/mL.
3. Zentrifugieren bei 12.000 U/min für 20 Minuten bei 4 °C. Vorsichtig das Zentrifugier-Röhrchen aus der Zentrifuge entnehmen und auf Eis legen. Übertragen Sie das Überstand in ein neues vorab gekühltes Röhrchen auf Eis.

II. Probenvorbereitung

1. Eine kleine Menge Lysat für die Proteinquantifizierung entnehmen. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration jedes Zell-Lysats.
2. Bestimmen Sie das Protein-Loading-Menge und fügen Sie 1/4 Volumen des 5X Probepuffers hinzu.
3. Für Probenreduktion und Denaturierung den gemischten Probepuffer bei 100 °C für 5 Minuten kochen.

III. Loading und Gel-Ausführung

1. Bereiten Sie die Proben in SDS-PAGE-Gel-Wellen ein. Die Gesamtprotein-Loading-Menge für Zell-Lysate oder Gewebshomogenisate beträgt 20-30 μg und für gereinigte Proteine 10-100 ng.
2. Führen Sie das Gel bei 100 V für 1-2 Stunden durch. Zeit und Spannung können optimiert werden. Wir empfehlen, den Anweisungen des Herstellers zu folgen. Es sei denn, der Antikörper-Datenblatt empfiehlt ansonsten, verwenden Sie ein reduzierendes Gel.

Gel-Prozent basierend auf Proteingröße

Auch Gradientengele können verwendet werden.

IV. Proteintransfer vom Gel zur Membran

Die Membran kann Nitrocellulose oder PVDF sein. PVDF-Membranen werden häufig verwendet und müssen mit Methanol für 1 Minute aktiviert werden, bevor sie verwendet werden und mit Transfer-Puffer gewaschen werden, bevor der Transfer-Stack vorbereitet wird. Übertragungszeit und Spannung müssen je nach Transfer-Puffer optimiert werden, und wir empfehlen, den Anweisungen des Herstellers zu folgen. Proteintransfer kann vor dem Blocking-Schritt mit Ponceau S-Färbung überprüft werden.

V. Blocking und Antikörper-Inkubation

1. Blockieren Sie die Membran mit Blockpuffer (5% geschobene Milch/1% BSA) für 1 Stunde bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C.
2. Entfernen Sie die Blocklösung und verdünnen Sie das Primärantikörper mit Antikörperverdünnungspuffer gemäß den Anweisungen des Herstellers. Inkubieren Sie die Membran über Nacht bei 4 °C oder für 2 Stunden bei Raumtemperatur.
3. Waschen Sie die Membran dreimal mit TBST, jeweils 5 Minuten.
4. Verdünnen Sie das konjugierte Sekundärantikörper mit Antikörperverdünnungspuffer gemäß den Anweisungen des Herstellers und inkubieren Sie die Membran für 1 Stunde bei Raumtemperatur.
5. Waschen Sie die Membran dreimal mit TBST, jeweils 5 Minuten.

VI. Detektion (ECL-Methode)

1. ECL Arbeitslösungsvorbereitung: Mischen Sie gleiche Volumina der Lösung A und der Lösung B.
2. Inkubation: Bedecken Sie die Membran-Oberfläche gleichmäßig und inkubieren Sie bei Raumtemperatur im Dunkeln für 1 Minute.
3. Entfernen des überschüssigen Liquids: (lassen Sie die Membran nicht trocknen).
4. Aussetzen: Aussetzen auf Röntgenfilm in einem Dunkelraum (5 Sekunden bis 10 Minuten).

VII. Puffer-Rezepte

RIPA-Lysierungspuffer

50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,5% Natriumdeoxycholat, 0,1% SDS. Fügen Sie vor der Verwendung einen 1X-Proteaseinhibitoren-Cocktail hinzu.

Transfer-Puffer

25 mM Tris-Basis, 190 mM Glycin, 20% Methanol (für PVDF-Membranen), 10% Methanol (für Nitrocellulose-Membranen).

TBST Waschen-Puffer

20 mM Tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl, 0,1% Tween-20.