Fluorfarbstoffe oder Markermerkmale

Fluor350 ist ein exzellenter blauer fluoreszierender Farbstoff, ein modifizierter Farbstoff auf Basis des Coumarin-Farbstoffs 7-AMCA-Gerüst. Er kann als hervorragende Alternative zu AMCA dienen, wird häufig in Fluoreszenzbildgebung und Durchflusszytometrie-Analyse verwendet, mit guter Wasserlöslichkeit und pH-Unempfindlichkeit. Die Anregungs- und Emissionsspektren von Fluor350 sind denen von DAPI nahe, und er kann direkt mit DAPI Filtersets abgebildet werden.

Abbildung 1: Schematische Darstellung der Fluor350SE chemischen Struktur, zeigt seine Molekülzusammensetzung und Bindungsmethode

Abbildung 2: Fluor350 Anregungs- und Emissionsspektren, zeigt seine Charakteristiken der Anregung bei 346nm und Emission bei 445nm

Abbildung 3: Vergleich von Fluor350 und naheliegendem Farbstoff-Spektren (AMCA, DAPI)

Abbildung 4: Vergleich der relativen Fluoreszenzintensität zwischen Fluor350 und AMCA, zeigt die exzellente Leistung von Fluor350 nach Proteinmarkierung

Das Anregungs/Emissions-Maximum des Fluor405 blauen fluoreszierenden Farbstoffs ist 400/424nm, was die Spektrallinien des weit verbreiteten 405nm Violett-Lasers in der Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie fast perfekt entspricht. Die Anregungs- und Emissionsspektren von Fluor405 überlappen stark mit denen des BV421-Farbstoffs. Fluor405 ist ein Derivat des Cascade Blue-Farbstoffs, aber mit optimierten Fluoreszenz-Eigenschaften nach struktureller Modifikation. Das Spektralüberlagerung zwischen Fluor405 Farbstoff und grünen Fluoreszenzfarbstoffen ist minimal, was ihn zu einer idealen Wahl für Mehrfarben-Anwendungen macht.

Abbildung 1: Schematische Darstellung der Fluor405SE chemischen Struktur, zeigt seine Molekülzusammensetzung und Bindungsmethode

Abbildung 2: Fluor405 Anregungs- und Emissionsspektren

Abbildung 3: Vergleich von Fluor405 und naheliegendem Farbstoff-Spektren (DyLight 405, BV421)

Unter aktiven Farbstoffen, die Licht im Wellenlängenbereich von 400-450nm absorbieren, wird in der Regel keine signifikante Fluoreszenz oberhalb von 500nm produziert. Der Fluor430 Farbstoff füllt diese Lücke im Wellenlängenbereich. Wenn er nahe seinem Absorptionsmaximum bei 430nm angeregt wird, zeigt dieser Farbstoff eine große Stokes-Verschiebung und intensive gelb-grüne Fluoreszenz.

Abbildung 1: Schematische Darstellung der Fluor430SE chemischen Struktur, zeigt seine Molekülzusammensetzung und Bindungsmethode

Abbildung 2: Fluor430 Anregungs- und Emissionsspektren

Fluor488 ist sulfoniertes Rhodamin Grün. Durch das Einführen zwei Sulfonat-Ionen hat Fluor488 seine Wasserlöslichkeit, pH-Stabilität und Photostabilität signifikant erhöht. Im Gegensatz zu Fluorescein-Farbstoffen bleibt die Fluoreszenz von Fluor488 über einen breiten pH-Bereich (4-10) unverändert. Aufgrund seiner mehreren negativen Ladungen ist Fluor488 weniger anfällig für intermolekulare Aggregation, und wenn mehrere Farbstoff-Moleküle das gleiche Protein markieren, ist es weniger anfällig für Fluoreszenz-Selbstauslöschung oder Proteine-Aggregation. Fluor488 ist eine hervorragende Alternative zu Fluorescein (FITC oder FAM) und CY2, führt extrem gut in Einzelmolekül-Detektion von Bio-Konjugaten, Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie und Fluoreszenz-Polarisations-Messungen. Er wird auch weit verbreitet in der Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie verwendet. Fluor488 ist derzeit einer der besten wasserlöslichen kleinen Moleküle grün fluoreszierenden Farbstoffe.

Abbildung 1: Schematische Darstellung der Fluor488SE chemischen Struktur, zeigt seine Molekülzusammensetzung und Bindungsmethode

Abbildung 2: Fluor488 Anregungs- und Emissionsspektren

Abbildung 3: Vergleich von Fluor488 und naheliegendem Farbstoff-Spektren (Cy2, FITC)

Abbildung 4: Vergleich der relativen Fluoreszenzintensität zwischen Ziegen anti-Maus IgG Konjugaten, hergestellt mit Fluor 488 Farbstoff und Fluorescein Isothiocyanat (FITC). Verwendung derselben Menge an Antikörpern zeigen die Ergebnisse, dass Fluor 488-markierte Antikörper eine höhere Fluoreszenz-Helligkeit aufweisen.

Abbildung 5: Helligkeitsvergleich zwischen Fluor488-markierten Kaninchen anti-Maus IgG Antikörpern und Cy2-markierten Kaninchen anti-Maus IgG Antikörpern. Menschliche Blutzell-Proben wurden zunächst mit normalem Kaninchen-Serum blockiert, dann inkubiert mit anti-CD3 Maus monoklonale Antikörpern, Zellen wurden gewaschen, resuspendiert und dann inkubiert mit derselben Konzentration von Fluor 488 oder Cy2-markierten Kaninchen anti-Maus IgG Sekundärantikörpern. Nach Erythrozyten-Lyse zeigte die Durchflusszytometrie-Detektion, dass Fluor488-markierte Sekundärantikörper effektiver waren.

Abbildung 6: Verwendung von Fluor488 und FITC zur direkten Markierung anti-Maus CD4 monoklonaler Antikörper, unter Verwendung der gleichen Menge an Antikörpern, detektierte Durchflusszytometrie Signalintensität, Fluor488-markierte anti-Maus CD4 hatten stärkere Fluoreszenz-Signalintensität.

Fluor555 ist ein orange-orang-roter fluoreszierender Farbstoff, ein Analogon von Cyanine3, wird häufig verwendet um Cyanine3 und TAMRA-Farbstoffe zu ersetzen. Fluor555 Farbstoff hat hohe Polarität, starke Wasserlöslichkeit, exzellente Fluoreszenz-Helligkeit und Fluoreszenz-Stabilität, was ihn zu einem guten Farbstoff für Protein/Antikörper-Markierung macht. Aus chemischer Struktur-Perspektive ist das Mutterkern von Fluor555 Cyanine3, aber das Mutterkern hat bis zu 4 Sulfonsäure-Gruppen. Die Tetrasulfonsäure-Struktur macht ihn extrem hydrophil, und wenn der Farbstoff auf der Proteinoberfläche markiert wird, ändert er nicht die Proteinoberflächen-Polarität, reduziert das Risiko von Protein-hydrophober Aggregation und Ausfällung, und verringert deutlich die Wahrscheinlichkeit von Fluoreszenz-Auslöschung aufgrund lokaler Nähe des Farbstoffs. Daher emittieren Proteine, die mit Fluor555 markiert sind, oft stärkere Fluoreszenz. Allerdings, da die meisten Durchflusszytometer derzeit auf dem Markt traditionelle Durchflusszytometer sind (nicht Spektral-Durchflusszytometer), ist die Laser-Kompatibilität nicht optimal, daher wird Fluor555 Farbstoff mehr im Bereich der Fluoreszenzbildgebung verwendet.

Abbildung 2: Fluor555 Anregungs- und Emissionsspektren

Abbildung 3: Vergleich von Fluor555 und naheliegenden Farbstoffen (Cy3, TRITC)

Abbildung 4: Durch kontinuierliches Beleuchten äquimolarer Konzentrationen von freiem Fluor 555 und Cy3, wurden Datenpunkte alle fünf Sekunden gesammelt. Fluoreszenzintensität wurde auf dieselbe Anfangsintensität normalisiert. Die Ergebnisse zeigen, dass Fluor 555 eine exzellentere Resistenz gegen Photobleaching hat.

Abbildung 5: Vergleich der relativen Fluoreszenzintensität zwischen Fluor555 und Cy3 zwei Farbstoff-konjugierten Ziegen anti-Kaninchen IgG Antikörpern bei unterschiedlichen Farbstoff-zu-Protein Bindungsverhältnissen. Es zeigt, dass Fluor555 höhere relative Fluoreszenzintensität hat, und das Signal zerfällt nicht wenn der Grad der Markierung (DOL) so hoch wie 8 oder höher ist.

Fluor568 fluoreszierender Farbstoff passt perfekt 561nm Lasern. Das Maximum Anregungs/Emissions dieses rot-orangen Fluoreszenzfarbstoffs ist ungefähr 578/602nm, was optimale Anregungseffekt im 561nm Diode-Laser verwendet in vielen konfokalen Laser-Scan-Mikroskopen erreichen kann. Fluor568 hat ein Mutterkern von Rhodamin-Vereinigungen, und zwei Sulfonat-Ionen werden eingeführt um die Wasserlöslichkeit und optischen Eigenschaften des Farbstoffs zu optimieren. Wenn angeregt, emittiert er helle rot-orange Fluoreszenz, was sehr empfindlich und stabil ist, und kann verwendet werden um niedrig-abundante Ziele zu detektieren. Er ist ein exzellenter wasserlöslicher kleiner Moleküle fluoreszierender Markierung Farbstoff.

Abbildung 2: Fluor568 Anregungs- und Emissionsspektren

Abbildung 3: Vergleich von Fluor568 und naheliegendem Farbstoff-Spektren (Rhodamin Rot)

Fluor594 ist ein Rhodamin-Vereinigung methylisiert auf Basis von Fluor568 Struktur. Zwei Sulfonat-Ionen spielen auch eine Rolle bei der Optimierung der Eigenschaften des Farbstoffs. Wenn angeregt, emittiert er helle rote Fluoreszenz, was sehr empfindlich und stabil ist, und kann verwendet werden um niedrig-abundante Ziele zu detektieren. Fluor594 ist ein exzellenter wasserlöslicher kleiner Moleküle fluoreszierender Markierung Farbstoff, geeignet zur Markierung verschiedener Zielmolekülen, und weit verbreitet in verschiedenen biologischen Experimenten. Konjugate hergestellt mit Fluor594 Farbstoff emittieren Fluoreszenz im roten Bereich des Spektrums, daher sind sie besonders gut für Multiplex-Markierungs-Experimente kombiniert mit grünen Fluoreszenz-Sonden geeignet. Die Spektral-Eigenschaften von Fluor594 sind denen von Cyanine3.5 und Texas Red ähnlich, aber die Fluoreszenzintensität ist stärker, was ihn zu einem exzellenten Ersatz für Texas Red macht.

Abbildung 1: Schematische Darstellung der Fluor594SE chemischen Struktur, zeigt seine Molekülzusammensetzung und Bindungsmethode

Abbildung 2: Fluor594 Anregungs- und Emissionsspektren

Abbildung 3: Vergleich von Fluor594 und naheliegendem Farbstoff-Spektren (DyLight 594, Texas Red)

Abbildung 4: Vergleich der relativen Fluoreszenzintensität zwischen Fluor 594 und Texas Red-X markierten Kaninchen anti-Maus IgG Antikörpern bei unterschiedlichen Farbstoff-zu-Protein Verhältnissen. Es zeigt, dass Fluor 594 stärkere Fluoreszenzintensität hat.

Das Spektrum des Fluor647 fluoreszierenden Farbstoffs stimmt fast vollständig mit dem von Cyanine5 überein, daher ist auch die Kompatibilität mit optischen Filtern für Cyanine5 optimal. Allerdings ist die gesamte Fluoreszenzintensität von Fluor647 Antikörper-Konjugaten in der Regel signifikant höher als bei Cyanine5 Konjugaten. Außerdem, wenn Fluor647 mit den meisten Proteinen, Oligonukleotiden und Nukleinsäuren konjugiert wird, zeigt seine Absorption oder Fluoreszenzspektrum fast keine Änderung, daher unter demselben Grad der Substitution ist die gesamte Fluoreszenzintensität höher, was ihn zu einem exzellenten Ersatz für Cyanine5 macht.

Abbildung 1: Fluor647 Anregungs- und Emissionsspektren

Abbildung 2: Vergleich von Fluor647 und naheliegendem Farbstoff-Spektren (APC, Cy5)

Abbildung 3: Vergleich der Helligkeit von Fluor647 und Cy5 fluoreszierendem Farbstoff Antikörper-Konjugaten. Es zeigt, dass die Helligkeit von Fluor 647 Konjugaten viel höher ist als bei Konjugaten mit Cy5.

Das Peak-Anregungs-Wellenlänge des Fluor680 Farbstoffs ist 680nm, und das maximale Emissions-Wellenlänge ist 702nm. Seine Spektral-Eigenschaften sind denen von Cyanine5.5 Farbstoff ähnlich. Die Fluoreszenz von Fluor680 Farbstoff ist deutlich getrennt von den Emissionssignalen anderer gängiger roter fluoreszierender Farbstoffe (wie Tetramethylrhodamin, R-Phycoerythrin, Fluor594 und Fluor647), daher ist er sehr gut für Mehrfarben-Markierung geeignet.

Abbildung 1: Fluor680 Anregungs- und Emissionsspektren

Abbildung 2: Vergleich von Fluoreszenz-Spektren zwischen Fluor680 und Cy5.5. Es zeigt, dass ihre Spektren im Wesentlichen übereinstimmen.

Fluor750 ist spektral sehr ähnlich Cyanine7 Farbstoff, und ist ein exzellenter Ersatz für Cyanine7. Das maximale Fluoreszenz-Emissions-Wellenlänge ist 770nm, was weit entfernt vom maximalen Emissions-Wellenlänge von gängigen fern-roten fluoreszierenden Substanzen (Fluor647 oder APC) ist, was bequeme Mehrfarben-Analyse ermöglicht.

Abbildung 1: Fluor750 Anregungs- und Emissionsspektren

Abbildung 2: Vergleich von Fluor750 und naheliegendem Farbstoff-Spektren (Cy7)