Technologie zur Herstellung monoklonaler Antikörper

Monoklonale Antikörper sind durch das Klonen eines einzelnen B-Zells produzierte Antikörper und erkennen ein einziges antigenspezifisches Epitop. Sie zeichnen sich durch hohe Spezifität, hohe Homogenität und Massenproduktion aus.

Die Technologie zur Herstellung monoklonaler Antikörper ist eine Schlüsseltechnologie im Bereich Biologie und Medizin, die 1975 vom deutschen Biologen Georges Jean Franz Köhler und dem argentinisch/britischen Biologen César Milstein entwickelt wurde. Dafür erhielten sie den Nobelpreis für Physiologie oder Medizin. Durch die Fusion von B-Lymphozyten mit Myelomzellen werden Hybridoma-Zellen gebildet, aus denen Zelllinien mit Antikörpersekretionsfähigkeit und unbeschränkter Proliferationsfähigkeit mittels HAT-Auswahlmedium selektiert werden, um eine groß angelegte Herstellung einzelner Antikörper zu ermöglichen. Dies ist die traditionelle Hybridom-Technik, die dem Publikum bekannt ist und bis heute verwendet wird. Monoklonale Antikörper haben vier Phasen durchlaufen: murine Antikörper, human-mäuse-chimäre Antikörper, humanisierte Antikörper und vollständig humane Antikörper. Die entsprechende Technologie zur Herstellung monoklonaler Antikörper hat eine kontinuierliche Entwicklung und Verbesserung von der Pionierphase der Hybridom-Technologie bis hin zur Phagen-Display-Technologie, transgenen Tier-Technologie und Einzel-B-Zell-Technologie erfahren.

Die ursprünglichen monoklonalen Antikörper wurden unter Verwendung von Maus-abgeleiteten Proteinen erzeugt, waren aber bei längerer Anwendung beim Menschen nicht verträglich. Um die Immunogenität der murinen monoklonalen Antikörper zu überwinden und ihre biologische Wirksamkeit beim Menschen zu optimieren, entwickelten Wissenschaftler anschließend mouse-human chimäre Antikörper. Durch genetische Engineering-Technologie wird die Variablenregion von Maus-Antikörpern mit der konstanten Region von Human-Antikörpern fusioniert; nur das aus der Maus stammende antigenbindende Zentrum bleibt in der Struktur erhalten, während der Rest durch humane Antikörper-Sequenzen ersetzt wird, was seine Verträglichkeit und Wirksamkeit beim Menschen erheblich verbessert. Mit dem kontinuierlichen Fortschritt der Technologie haben Wissenschaftler erfolgreich vollständig humanisierte Antikörper mittels Phagen-Display-Technologie und transgener Maus-Technologie entwickelt, wodurch die Produktionseffizienz und -kapazität von Human-Antikörpern weiter verbessert wurde. Diese Innovationen haben das klinische Anwendungsgebiet und das Marktwachstum monoklonaler Antikörper vorangetrieben.

1. Hybridom-Technologie

Das Grundprinzip besteht darin, die Tatsache auszunutzen, dass B-Lymphozyten einen einzelnen spezifischen Antikörper produzieren können, aber sich in vitro nicht unendlich vermehren, während Myelomzellen sich in vitro unendlich vermehren können, jedoch keine Antikörper produzieren. Die Zellen haben die Vorteile beider Seiten, und durch Selektion und Kultivierung können zahlreiche Hybridoma-Zelllinien erhalten werden, die monospezifische Antikörper produzieren, woraufhin monoklonale Antikörper hergestellt werden können. Als Eckpfeiler hat die Hybridom-Technologie erstmals die groß angelegte Herstellung monoklonaler Antikörper ermöglicht und ist trotz Einschränkungen wie Maus-Heritage, Produktionseffizienz und Zelllinien-Stabilität aufgrund ihrer ausgereiften Technologie, relativ einfachen Operationen und niedrigen Kosten nach wie vor in Laboratorien und Industrien weit verbreitet.

2. Phagen-Display-Technologie

Das Prinzip der Phagen-Display-Technologie besteht darin, kodierende Gen-Fragmente von exogenen Proteinen und Peptiden durch genetische Engineering-Technologie in die geeignete Position der Gen-Sequenz einzufügen, die das Hüllprotein des Bakteriophagens codiert. Das fremde Protein oder Peptid fusioniert mit dem Phagen-Hüllprotein zu einem Fusionsprotein, das sich beim Zusammenbau der Nachkommen-Phagen auf der Oberfläche des Phagens ausdrückt. Fusionsproteine behalten ihre räumliche Struktur und biologische Aktivität bei und können Zielmoleküle erkennen und binden. Die grundlegenden Schritte zur Herstellung monoklonaler Antikörper mit Phagen-Display-Techniken umfassen: (1) Erstellung einer Phagen-Bibliothek, die Antikörper-DNA-Sequenzen enthält, und Bewertung der klonalen Diversität der Bibliothek. (2) Der gereinigte Zielantigen wurde verwendet, um nicht-spezifisch gebundene Phagen durch Screening und Auslesen zu eliminieren. (3) Auswahl monoklonaler Phagen, Detektion der Spezifität mittels ELISA und Identifizierung positiver Klone durch Sequenzierung. (4) Subklonierung des positiven Antikörper-Gens in das Expressionsvektor, Transfektion der Wirtzelle zur Induktion der Expression und Reinigung des Antikörpers mittels Affinitätschromatographie und anderer Methoden sowie Überprüfung seiner Aktivität durch Experimente. Die beiden Schlüsselbereiche sind die Konstruktion von Antikörper-Phagen-Bibliotheken und das Screening von Antikörpern.

 3. GMO-Tier-Technologie

Aus gewöhnlichen Mäusen hergestellte Antikörper sind "mäuse-abgeleitet". Wenn sie in den Körper injiziert werden, erkennt das Immunsystem des Körpers dies als fremdes Substanz und greift an, was dazu führt, dass das Antikörper-Medikament versagt und potenziell schwere Nebenwirkungen verursachen kann. Obwohl diese Ablehnung durch "humanisierte Modifikation" gemildert werden kann, ist der Prozess komplex und kann dennoch einige Merkmale des Ratten-Heritage behalten. Die Wissenschaftler entwickelten dann mouse-human chimäre Antikörper. Durch genetische Engineering werden die endogenen Gene, die für die Codierung der schweren und leichten Ketten von Antikörpern in Tieren verantwortlich sind, inaktiviert oder direkt ausgeschaltet. Import ungerangierter Antikörper-Gen-Kluster aus dem Menschen in das Maus-Genom. Auf diese Weise vollenden tierische B-Zellen eine Reihe komplexer Immunprozesse wie V(D)J-Umordnung menschlicher Ig-Gene im Körper, was zur Produktion von "vollständig human" oder hochgradig humanisierten Antikörpern führt. Sobald solche transgenen Mäuse verfügbar sind, können vollständig humane monoklonale Antikörper unter Verwendung der traditionellen Hybridom-Technologie oder Einzel-B-Zell-Technologie hergestellt werden.

 4. Einzel-B-Zell-Technologie

Die Einzel-B-Zell-Technologie umgeht die Zellfusion in traditionellen Hybridom-Techniken und zielt direkt auf eine einzelne antigen-spezifische B-Zelle. Durch Nutzung von Durchflusszytometrie, Mikrofluidik-Chips und anderen Technologien werden einzelne B-Zellen, die spezifisch an Zielantigene binden können, genau aus peripherem Blut, Milz und anderen Geweben selektiert und isoliert, die gegen Tiere oder Immunkörper immunisiert wurden. Entweder durch direkte Amplifikation der schweren Kette (VH) und leichten Kette (VL) Variablenregion-Genen ihrer Antikörper mittels RT-PCR, oder durch Kultivierung einzelner B-Zellen in vitro-Kultursystemen zur Sekretion von Antikörpern und anschließendes Klonen der Antikörper-Gene. Die amplifizierten Antikörper-Gene werden in geeignete Expressionsvektoren eingefügt, transfeziert in Wirtzellen für Expression und Reinigung und schließlich monoklonale Antikörper mit spezifischer Bindungsfähigkeit erhalten.

Diese neuen Technologien haben ihre eigenen Vorteile und spielen eine wichtige Rolle in verschiedenen Anwendungsszenarien, gemeinsam fördern sie den Fortschritt und die Entwicklung der monoklonalen Antikörper-Technologie und bringen revolutionäre Veränderungen im Bereich Biomedizin. Heute sind humane monoklonale Antikörper die am schnellsten wachsende Kategorie monoklonaler Antikörper-Therapeutika, die klinischen Studien betreten.

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Vergleich der vier Technologien

Felicia Felicia ist eine technische Support-Spezialistin bei EnkiLife, mit ausgedehnter professioneller Erfahrung in Antikörper-Entwicklung, Optimierung und ELISA-Assay-Gestaltung und Anwendung. Sie widmet sich dem Assistentieren unserer Kunden bei der Auswahl geeigneter Antikörperprodukte, der Optimierung von ELISA-experimentellen Protokollen und der Lösung technischer Herausforderungen, die im Prozess auftreten, wodurch sie den reibungslosen Fortschritt ihrer Life-Science-Forschungsprojekte unterstützt.