Wissensvertrittung: Multiflokuläre Immunfluoreszenzanalyse früherer Dreifach-negativer Brustkrebs

Literatur-Sharing: Multiplex-Immunfluoreszenz-Analyse von frühem Triple-negativem Brustkrebs

Hintergrund

Triple-negativer Brustkrebs (TNBC) ist die aggressivste Untergruppe des Brustkarzinoms und weist eine sehr schlechte Prognose sowie begrene Behandlungsmöglichkeiten für fortgeschrittene Patienten auf. Im Vergleich zu anderen Brustkrebstypen zeigt TNBC eine höhere Immunogenität mit hoher Anreicherung von tumorinfiltrierenden Lymphozyten (TILs) und hohen PD-L1-Expressionswerten, wodurch er eine potenziell geeignete Population für die Immuntherapie darstellt. Vorherige Studien haben bestätigt, dass stromale tumorinfiltrierende Lymphozyten (sTILs) prognostischen prädiktiven Wert in TNBC aufweisen und das Ansprechen auf neoadjuvante und adjuvante Chemotherapie vorhersagen können; derzeit wurden TILs jedoch noch nicht in die routinemäßigen klinischen Bewertungssysteme integriert. Die International Breast Cancer Study Group (IBCSG) 22-00-Studie ist eine Phase-III-randomisierte klinische Studie, die darauf abzielt, die Wirksamkeit einer niedrigdosierten oralen Cyclophosphamid-Methotrexat-(CM)-Erhaltungsbehandlung bei frühem hormonrezeptor-negativem Brustkrebs nach standardmäßiger adjuvanter Chemotherapie zu bewerten. Vorherige Studien zeigten, dass die CM-Erhaltungsbehandlung keinen statistisch signifikanten Effekt auf die Reduzierung des Rezidivrisikos bei TNBC-Patienten hatte, aber Patienten mit hohen sTILs-Werten (>500) ein ausgeprägteres Rückgang des Brustkrebsrezidivrisikos nach Erhalt der CM-Erhaltungsbehandlung zeigten. Basierend darauf charakterisierte Rusakiewicz S et al. die Merkmale der Immunzellinfiltration bei TNBC-Patienten durch 6-Farben-Immunfluoreszenz-Färbungstechnologie, bewertete den prognostischen Wert bestimmter Immunsellsubsets und ihre prädiktive Rolle in der Wirksamkeit der CM-Erhaltungsbehandlung, während gleichzeitig der Einfluss der räumlichen Verteilungsmerkmale von Immunzellen auf die Behandlungswirksamkeit und Patientenprognose analysiert wurde. Dies liefert Evidenz für die Entwicklung von präzisen Behandlungsstrategien für TNBC-Patienten.

Forschungsmethoden

Die Studienteilnehmergruppe wurde aus der Intention-to-treat-Population des IBCSG 22-00-Versuchs abgeleitet, wobei der bestätigte TNBC-Status durch zentralisierte Pathologie-Bewertung ermittelt wurde und formalin-fixierte Paraffin-eingebettete (FFPE) Gewebeschnitte sowie TILs-Ergebnisse vorliegen. FFPE-Gewebeschnitte wurden HE-Färbung und multiplex Immunfluoreszenz (mIF)-Färbung unterzogen. HE-geschichtete Schnitte wurden von Pathologen revidiert, um den Gewebetumorinhalt zu bestätigen und Regionen des Interesses abzugrenzen. Die mIF-Färbung wurde nach Entwachsung, Epitop-Abholung und Blockade endogener Peroxidase durchgeführt, gefolgt von sequentieller Inkubation mit Primärantikörpern gegen CD4, FOXP3, CD3, Zytokeratin, CD8, HRP-markierte Sekundärantikörper und spezifischen Fluoreszenzfarbstoffen, sowie abschließender Färbung mit Spectral DAPI zur Kernfärbung und Einlagerung; die Proben wurden bei 4°C im Dunkeln gelagert und multiplex IF-Bilder innerhalb von 48h mittels eines Vectra 3.0 Bildgebungssystems erhalten. Gewebespezifische und kanalspezifische Spektrallibraries für jeden Fluoreszenzfarbstoff in jedem Kanal sowie Tumorgewebe-Autofluoreszenz wurden gesammelt, um optimale immunfluoreszenz-basierte Signalunmischung und Multiplex-Analyse zu erreichen. Nach dem Vor-Scannen immunfluoreszenzfärbter Schnitte mit 10× Objektiv wurde Phenochart™ Whole-section Observation Software verwendet, um Regionen des Interesses enthaltende Tumorzellinseln und Stroma anzumerken, gefolgt von 20× Objektiv hochauflösender Multispektral-Bildaufnahme. Mittels inForm 2.3.0-Software wurden Tumor- und Stromaregionen basierend auf Zytokeratin-Färbung unterschieden, Zellsegmentierung erfolgte mittels DAPI-Färbung, und Immunsellsubsets wurden durch aktive Lernungs-Phänotyp-Algorithmen quantifiziert; Zellpopulationsdaten wurden schließlich exportiert und mit selbst entwickelten R-Skripten verarbeitet. Zusätzlich wurden Tumore basierend auf CD3⁺ Zellinfiltrationsstatus in Stroma und Epithel in Kategorien "inflammierte Typ" (CD3⁺ Zellen infiltrieren sowohl Stroma als auch Tumor), "exkludierter Typ" (CD3⁺ Zellen infiltrieren hauptsächlich Stroma) und "kalten Tumor" (sehr geringe CD3⁺ Zellinfiltration) eingeteilt.

Zusammenhang zwischen Immunzellinfiltration und Patientenprognose

Die multiplex Immunfluoreszenz-Detektion wurde an Tumorgewebeschnitten von 204 Patienten durchgeführt, um die Immunzellinfiltration in Tumoren zu beobachten. Das Experiment markierte gleichzeitig 6 Schlüsselmarker: Verwendung von CK zur Lokalisierung von Krebszellen, Nutzung von CD3, CD4, CD8 zur Kennzeichnung verschiedener T-Zell-Typen, Verwendung von FoxP3 zur Markierung regulatorischer T-Zellen mit immunsuppressiven Funktionen und schließlich Nutzung von DAPI zur Markierung aller Zellkerne. Die Bilder zeigen klar die individuellen Färbungseffekte jedes Markers, entsprechende Geweblichtmikroskopie-Bilder und kombinierte Färbungsergebnisse. Aus den Detektionsergebnissen dieses Falls wurde festgestellt, dass obwohl das Tumorsample reich an Immuninfiltration war, keine Immunzellinfiltration in den CK-positiven Tumorzellnestbereich vorlag.

Für die multivariate Analyse aller Immunzellinfiltrationsdaten wurde eine Hauptkomponentenanalyse verwendet. Die Ergebnisse zeigten, dass die erste Hauptkomponente 73 % der Variation in allen detektierten Markern erklären konnte, was darauf hindeutete, dass diese Dimension die Immuninfiltrationsmerkmale des Tumors gut zusammenfassen konnte. Aus den Gesamtpatientendaten ergab sich: Je mehr Immunzellen im Tumorgewebe vorhanden waren, desto geringer war das Risiko der Patienten für Fernrezidive und desto länger war die fernrezidivfreie Überlebenszeit. Dieser Trend war insbesondere bei Patienten mit Lymphknotenmetastasierungen ausgeprägt. Es gab jedoch auch ein gegenteiliges Ergebnis: Bei Patienten ohne Lymphknotenmetastasierung und mit sehr wenigen Immunzellen im Tumor schien ihre Prognose nach CM-Erhaltungsbehandlung zu verbessern, wobei das Rezidivrisiko reduzierte. Dieses Ergebnis muss jedoch noch durch mehr Patientendaten validiert werden, um seine Zuverlässigkeit zu bestätigen.

Zusammenhang zwischen Immunzellinfiltration undCMErhaltungsbehandlungswirksamkeit

Um den Einfluss der Immuninfiltration auf das Intervall fernrezidivfreier Überlebenszeit der Patienten (DRFI) zu klären, führte die Studie univariate Analysen bezüglich der Effekte von CD3, CD4, CD8 und anderen T-Zell-Subsets sowie stromalen tumorinfiltrierenden Lymphozyten und intraepithelialen tumorinfiltrierenden Lymphozyten durch. Hohe stromale tumorinfiltrierende Lymphozyt-Werte waren mit besserem DRFI assoziiert, insbesondere bei LN ⁺  Patienten. Unter diesen war die Wirkung von CD3+ stromalen tumorinfiltrierenden Lymphozyten in der Gruppe ohne CM-Behandlung prominenter, und das statistisch signifikante Interaktion zwischen den binären Variablen dieses Markers und Behandlungsgruppen deutete darauf hin, dass CM-Behandlung das DRFI in der Gesamtbevölkerung mit niedrigen stromalen tumorinfiltrierenden Lymphozyt-Werten und lymphknoten-negativen Patienten verbessern könnte. Hohe intraepitheliale tumorinfiltrierende Lymphozyt-Werte im Tumorgewebe hatten schwächere Verbesserungs Effekte auf DRFI und waren nur bei lymphknoten-positiven Tumorpatienten evident, während für Patienten mit lymphknoten-positiver Erkrankung und niedrigen intraepithelialen CD8+ tumorinfiltrierenden Lymphozyt-Werten CM-Erhaltungsbehandlung negative Effekte haben könnte.

Die Studie kombinierte weiter Behandlungsregime und Infiltrationsniveaus stromaler sowie intraepithelialer regulatorischer T-Zellen zur Bewertung des Patienten DRFI, wobei die relevanten Ergebnisse oben dargestellt wurden. Bei lymphknoten-positiven Patienten waren sowohl hohe stromale regulatorische T-Zell-Werte als auch hohe intraepitheliale regulatorische T-Zell-Werte mit längeremDRFI assoziiert, während Patienten mit niedrigen stromalen oder intraepithelialen regulatorischen T-Zell-Werten negative Effekte durch CM-Erhaltungsbehandlung erfahren könnten.

Einfluss der räumlichen Verteilung von Immunzellen

Abschließend bewertete die Studie die räumlichen Verteilungsmerkmale von Immunzellen in 204 Triple-negativen Brustkrebs-Proben und klassifizierte Proben basierend auf Infiltrationsstatus stromaler CD3⁺ T-Zellen und intraepithelialer CD3⁺ T-Zellen. Ausgewählte Tumoregionen des Interesses wurden zunächst visualisiert; Figur B zeigt typische Beispiele für immun-inflammierte, immun-exkludierte und einzelne immunkalte Tumorfälle, während Figur C die Verteilung von CD3-exkludierten versus inflammierten Typen unter 203 Triple-negativen Brustkrebs-Proben darstellt. Die DRFI-Analyse basierend auf dieser Klassifikation zeigte, dass CM-Erhaltungsbehandlung negative Effekte auf T-Zell-exkludierte lymphknoten-positive Proben haben könnte.

Fazit

In dieser Studie zu Triple-negativem Brustkrebs ist die multiplex Immunfluoreszenz-Technologie die Kernmethode zur Analyse des Tumorumgebungs-Immunmikroumfelds und zur Erschließung der Zusammenhänge zwischen Immuninfiltration und Prognose sowie Behandlungswirksamkeit. Durch 6-Marker-Kombinationsfärbung werden CD3⁺, CD4⁺, CD8⁺ T-Zellen und regulatorische T-Zellen präzise identifiziert und quantifiziert, die Infiltrationsorte dieser Immunzellen im Tumorstroma und Epithel geklärt sowie stromale/intraepitheliale tumorinfiltrierende Lymphozyten unterschieden; dies liefert grundlegende Daten für das Immünphänotyping. Zusätzlich können die gewonnenen Immundaten Zusammenhänge zwischen hohem CD3⁺ T-Zell- und regulatorischer T-Zell-Infiltration und DRFI aufzeigen, den Einfluss unterschiedlicher Immunmerkmale auf die CM-Behandlungswirksamkeit klären und immunphänotypische Evidenz für das Screening behandlungsfähiger Populationen liefern. Weiterhin kann diese Technologie die räumliche Verteilung von Immunzellen durch Multispektralbildgebung visualisieren, wodurch TNBC-Proben erfolgreich in inflammierte, exkludierte und kalte Tumortypen klassifiziert werden; dies bietet technische Unterstützung für die klinische Stratifizierung. Sie kann sich auch mit HE-Färbung koordinieren, um den Gewebeinhalt zu verifizieren, automatisierte Tools zur präzisen Einzelzellquantifizierung kombinieren, Einschränkungen einzelner Marker vermeiden und hochwertige Daten für statistische Analysen liefern.

Referenzen

Rusakiewicz S, Tyekucheva S, Tissot-Renaud S, Chaba K, Imbimbo M, Benedetti F, Kammler R, Hornfeld J, Munzone E, Gianni L, Thurlimann B, Láng I, Pruneri G, Gray KP, Regan MR, Loi S, Colleoni M, Viale G, Kandalaft L, Coukos G, Curigliano G. Multiplexed high-throughput immune cell imaging in patients with high-risk triple negative early breast cancer: Analysis from the International Breast Cancer Study Group (IBCSG) Trial 22-00. Eur J Cancer. 2024 Mar; 200:113535. doi: 10.1016/j.ejca.2024.113535. Epub 2024 Jan 24. PMID: 38309015.

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