MIICH-TSA-Experiment: Wichtige Technische Punkte und typische Fragen und Antworten

mIHC-TSA-Versuch: Wesentliche technische Punkte und typische Q&A

I. Wesentliche technische Punkte

1. Antigen-Retrieval: Das Antigen-Retrieval erfolgt typischerweise mit 1× Citronensäure (pH 6,0) als Retrievalsolution unter Hochtemperatur-Hochdruckbedingungen. Legen Sie die Schnitte in einen Druckkochtopf, geben Sie eine geeignete Menge Retrievalsolution hinzu, schließen Sie den Topf und lassen Sie ihn 2 Minuten lang nach dem Auftreten von Dampf einwirken. Abkühlenlassen auf Raumtemperatur vervollständigt das Retrieval. [Für Ziele mit schwacher Expression kann EDTA (pH 9,0) als Retrievalsolution verwendet werden. Für Gewebe, die zur Ablösung neigen (z. B. Knochen oder Hirngewebe), wird eine Mikrowellen-Retrieval-Methode empfohlen, wobei die Retrievaltemperatur auf etwa 80℃ kontrolliert wird und 2× Citronensäure (pH 6,0) als Retrievalsolution verwendet werden kann.]

2. Blockade endogener Enzyme: Verbinden Sie eine 3%ige H2O2-Lösung mit destilliertem Wasser, geben Sie die Schnitte in die Lösung und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 20 Minuten. Für Gewebe, die zur Ablösung neigen, reduzieren Sie die H2O2-Inkubationszeit angemessen. 

3. Antikörperauswahl und Verdünnung: Priorisieren Sie die Verwendung von monoklonalen Antikörpern und vermeiden Sie polyklonale Antikörper. Bei Maus-Proben versuchen Sie, mouse-abgeleitete Primärantikörper zu vermeiden. Wenn mouse-primäre Antikörper ausgewählt werden, bindet der sekundäre Antikörper nicht nur an den primären Antikörper, sondern auch an endogenes IgG im Gewebe, was zu einer unspezifischen Färbung führt. Das Verdünnungsverhältnis des Primärantikörpers muss durch Vorversuche bestimmt werden. Ein überhöht hoher Konzentration kann zu unspezifischer Bindung führen, während ein übermäßig niedriger Konzentrationsgrad zu schwachen Signalen führt. Es wird empfohlen, Konzentrationsgradienten einzurichten, um optimale Bedingungen zu screenen.

4. Spezifikationen für den TSA-Farbstoffgebrauch: TSA-Farbstoffe sind lichtempfindliche Substanzen, und Arbeitslösungen müssen frisch zubereitet werden. Für Ziele mit niedriger Expression wählen Sie Farbstoffe mit hoher Fluoreszenzintensität und starken Anti-Fading-Eigenschaften (wie Cy5, AF594), um die Detektionsrate durch den TSA-Signalverstärkungseffekt zu erhöhen. Für Ziele mit hoher Expression wählen Sie Farbstoffe mit moderater Fluoreszenzintensität (wie FITC, Cy3), um eine Signalübersättigung zu vermeiden, die Details maskieren könnte.

5. Vermeidung von spektraler Überlappung: Wählen Sie Farbstoffkombinationen mit Emissionswellenlängen, die ≥50nm voneinander entfernt sind, zum Beispiel: DAPI (461nm) + AF488 (519nm) + Cy3 (570nm) + Cy5 (670nm), was effektiv Kreuztalk reduzieren kann. Vermeiden Sie die gleichzeitige Verwendung von FITC (520nm) und AF488 (519nm) oder Cy3 (570nm) und AF594 (617nm).

6. Kompatibilität mit Bildgebungsausrüstung: Bei fluorozentrischem TSA muss bestätigt werden, ob die Fluoreszenzkanäle mit den Wellenlängen des Labor-Mikroskops kompatibel sind. Bei herkömmlichen Fluoreszenzmikroskopen können sowohl Konfokalmikroskope als auch Multispektral-Mikroskope verwendet werden. Vor dem Experiment ist es erforderlich, die Anzahl der Kanäle/Filter Ihres eigenen Instruments zu bestimmen, und die Priorität sollte den Fluoreszenzfarbstoffen gegeben werden, die mit den Instrumentfiltern übereinstimmen.

7. Effizienz der Antikörper-Elution: Wenn einige Antikörper hohe Titrierungen und starke Affinität aufweisen und nicht vollständig eluiert werden können, kann die Anzahl der Elutionsschritte erhöht werden, wobei darauf geachtet werden muss, dass die Schnitte während des Betriebs flach bleiben. Für Proben, die zur Ablösung neigen, kann die Temperatur des Elutionsmittels gesenkt oder die Inkubationszeit verkürzt werden.

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II. Häufige FAQs

1. Können gefrorene schwimmende Schnitte für TSA-Experimente verwendet werden?

Antwort: Das TSA-Kit ist nicht für schwimmende Schnitte geeignet. Da schwimmende Schnitte zu dick sind, was die Penetration der Reagenzien ungünstig macht. Schwimmende Schnitte können während der Färbung ihre Form verändern, z. B. sich wellen oder faltigen.

2. Wie wählt man Antikörper für paraffine Schnitte?

Antwort: Versuchen Sie, monoklonale Antikörper zu verwenden, wobei die Antikörperanwendungen als IHC/mIHC/IHC-P ausgewählt werden, und priorisieren Sie Antikörper, die durch Knockout-Experimente validiert wurden.

3. Warum tritt unspezifische Bindung auf?

Antwort: a. Wenn polyklonale Antikörper verwendet werden, neigen sie zur unspezifischen Bindung, die durch Wechsel zu monoklonalen Antikörpern oder Reduzierung von Konzentration und Retrieval-Intensität verbessert werden kann. b. Wenn die Signalverstärkung zu stark ist, reduzieren Sie die Farbreaktionszeit oder -konzentration. c. Wenn die Primärantikörper-Konzentration zu hoch ist oder das Antigen-Retrieval übermäßig ist, verwenden Sie ein niedrigeres Antikörper-Verdünnungsverhältnis oder reduzieren Sie die Intensität des Antigen-Retrievals.

4. Wie vermeidet man Schnittablösung?

Antwort: a. Wenn die Objektträger nicht gegen Ablösung behandelt wurden, verwenden Sie anti-ablösende Objektträger oder behandeln Sie die Objektträger mit Anti-Ablösungsmitteln. b. Wenn die Gewebefixierung unvollständig ist oder die Entwässerung unzureichend erfolgt, optimieren Sie die Methoden der Probenpräparation erneut, z. B. durch Verlängerung von Fixierungs- und Entwässerungszeiten. c. Wenn übermäßiges thermisches Antigen-Retrieval angewendet wird, verwenden Sie eine sanfte Mikrowellen-Retrieval-Methode mit einer Temperaturkontrolle bei etwa 80℃ oder niedriger, und 2× Citronensäure (pH 6,0) kann als Retrievalsolution verwendet werden. d. Wenn die Elutionslösungstemperatur zu hoch ist, reduzieren Sie die Elutionslösungstemperatur oder verkürzen Sie die Inkubationszeit.

5. Warum tritt Kreuztalk auf?

Antwort: a. Es könnte mit der Filterbandbreite der Bildgebungsausrüstung zusammenhängen; versuchen Sie, Filter mit schmaler Wellenlängenbandbreite zu verwenden. b. Es könnte mit unvollständiger Elution der vorherigen Antikörper-Runde zusammenhängen; bei Antikörpern mit hoher Affinität wie CK die Antikörper-Elutionsbedingungen verlängern (Erhöhung von Elutions Temperatur und Zeit etc.). c. Es könnte mit Signalungleichgewicht zusammenhängen, z. B. benachbarte Kanalfarbstoffe, von denen einer zu stark und der andere zu schwach ist, was zu Spillover des starken Signals führt. d. Weitere mögliche Gründe beinhalten das Verwechseln von Antikörpern oder Vergessen, im nächsten Durchgang zu eluieren/retrieval.

6. Für Maus-Proben, können mouse-abgeleitete Primärantikörper ausgewählt werden?

Antwort: Diese Methode wird im Allgemeinen nicht empfohlen, da, wenn der Primärantikörper aus Maus abgeleitet ist, auch der sekundäre Antikörper anti-Maus sein muss, was zu Kreuzreaktionen mit IgG führen kann, das bereits in der Probe vorhanden ist und zu unspezifischer Bindung. Wenn es notwendig ist, einen Primärantikörper aus derselben Spezies wie der Probe zu verwenden, wird empfohlen, ein negatives Kontrollexperiment durchzuführen, indem nur der sekundäre Antikörper ohne den primären Antikörper hinzugefügt wird, um festzustellen, ob unspezifische Signale entstehen.

7. Wie wählt man die Reihenfolge der Marker/Antikörper für Multiplex-Färbung?

Antwort: Platzieren Sie Antikörper, die schwierig zu eluieren sind, in der letzten Runde, um Kreuztalk zu vermeiden. Wechseln Sie zwischen Kaninchen- und Maus-Primärantikörpern. Platzieren Sie Marker, die schwer zu detektieren sind, in den früheren Runden. Für Ziele mit niedriger Expression wählen Sie Farbstoffe mit hoher Fluoreszenzintensität und starken Anti-Fading-Eigenschaften und platzieren Sie sie in den früheren Runden. Für Ziele mit hoher Expression wählen Sie Farbstoffe mit moderater Fluoreszenzintensität, um eine Signalübersättigung zu vermeiden, die Details maskieren könnte. Wenn zwei Proteine ko-exprimiert werden, wird empfohlen, Farbstoffe mit großen Wellenlängendifferenzen auszuwählen.

8. Ist es notwendig, während des experimentellen Betriebs Licht zu vermeiden? Wie lange können gefärbte Objektträger gelagert werden?

Antwort: Die Fluoreszenzfarbstoffe des Enklife TSA Kits zeigen eine hervorragende Anti-Fading-Leistung, sodass keine bewusste Lichtabdeckung erforderlich ist. Vermeiden Sie jedoch während der Verwendung die direkte Sonneneinstrahlung und längere Exposition. Gefärbte Objektträger können normalerweise 6 bis 12 Monate bei 4°C gelagert werden.

Enklife mIHC TSA Kits