Literaturübersicht: Praktische Fortschritte in der Multiplex-Immunohistochemie und Immunfluoreszenztechniken

Literaturübersicht: Praktische Fortschritte bei Multiplex-Immunohistochemie und Immunfluoreszenztechniken

1. Forschungsbackground

In den letzten Jahren ist die Analyse der komplexen Immunlandschaft des Tumor-Mikroenvironnements (TME) zum Kern der Präzisionsonkologie-Forschung geworden. Die routinemäßige klinische Praxis stützt sich jedoch weiterhin auf H&E-Färbungen und Einzelmarker-Chromogen-IHC-Detektion, was zu Einschränkungen wie Gewebeverlust, Unfähigkeit zur gleichzeitigen Auswertung mehrerer Marker und Ungeeignetheit für quantitative sowie räumliche Analysen führt. Dies erschwert die Erforschung des Tumor-Mikroenvironnements und die Vorhersage der Immuntherapie-Reaktion erheblich. Die Zellhäufigkeit und räumliche Anordnung des Tumor-Mikroenvironments beeinflussen Tumorentwicklung und Therapieansprechen. Bei der Verwendung von Einzel-IHC zur Auswertung von PD-L1-Expression zur Vorhersage des Immuntherapie-Ansprechens treten Probleme wie schlechte Reproduzierbarkeit, Unfähigkeit zur klaren Identifizierung der Expressionszellart und Schwierigkeiten bei der Quantifizierung räumlicher Anordnungen auf. Multiplex-Färbungen können durch fluoreszente oder chromogene Färbungen mehrere Proteine gleichzeitig gezielt werden, wodurch das Koexpressionsprofil und die räumliche Anordnung von Markern charakterisiert werden, was eine überlegene Leistung im Vergleich zu mehreren Detektionsmethoden bei der Vorhersage des Immuntherapie-Ansprechens zeigt. Sie haben einen breiten Anwendungswert in der Erforschung des Tumor-Mikroenvironments, räumlichen Heterogenitätsanalyse von Biomarkern, Lösung des Problems der Mehrmarker-Detektion bei kleinen Proben und Patientenstratifikation in klinischen Studien. Durch kontinuierliche Optimierung und sinkende Implementierungsschwierigkeiten eignen sie sich besser für die routinemäßige klinische Nutzung. "Multiplex Immunohistochemistry and Immunofluorescence: A Practical Update for Pathologists" ist ein Review-Artikel für Pathologen, der sich auf Multiplex-Immunohistochemie (mIHC) und Multiplex-Immunfluoreszenz (mIF)-Techniken konzentriert. Durch die gleichzeitige Detektion mehrerer Biomarker auf demselben Schnitt verbessert er erheblich den Informationsgehalt und die Genauigkeit der pathologischen Diagnostik. Derzeit umfassen die technischen Ansätze zur Erzielung einer Multiplex-Detektion hauptsächlich Multiplex-IHC/Immunfluoreszenz basierend auf TSA und anderen Methoden, Massenspektrometrie-Bildgebung (MSI) und digitale räumliche Profilierung (DSP), sowie virtuelle Multiplex-Färbungen durch konsequente Schnittregistrierung. Obwohl diese Techniken vorläufig noch Herausforderungen bei standardisierten Verfahren und Datenanalyse stellen, gewinnen sie mit der Reifung der digitalen Pathologie-Technologie zunehmend an Machbarkeit für klinische Translation und werden voraussichtlich in naher Zukunft zu einer routinemäßigen Methode zur Führung von Tumourimmuntherapie-Entscheidungen.

2. Konventionelle Einzel- und Doppelgewebsfärbung

Einzelne Chromogene Immunohistochemie

Die einzelne chromogene IHC wird verwendet, um ein einzelnes Antigen im Gewebe unter Hellfeld-Mikroskopie mit einer einzigen Farbe zu detektieren. Ihr Prinzip besteht darin, mit direkten oder indirekten enzym-verknüpften Antikörper-Strategien an der Antigen-Stelle Farbe zu entwickeln und das Gewebegrundgerüst mit Gegenfärbung anzuzeigen, um die Lokalisation und Expression des Zielantigens zu bestimmen.

Traditionell war die einzelne IHC aufgrund ihrer ausgereiften Technologie, niedrigen Kosten, einfachen Bedienung, kurzen Durchlaufzeit, permanenten Archivierung von gefärbten Slides und interpretierbaren Morphologie unter Lichtmikroskopie die bevorzugte Methode in der diagnostischen Pathologie. Sie hat zudem gut etablierte klinische Validierungsrichtlinien, und einige Marker können quantitativ mit Bildalgorithmen analysiert werden. Dennoch weist die einzelne IHC weiterhin offensichtliche Limitationen auf, einschließlich hauptsächlich des Verlassens auf pathologen-semi-quantitative manuelle Interpretation, was anfällig für interbeobachter-Variabilität ist. Unterschiede in experimentellen Verfahren zwischen verschiedenen Laboren beeinflussen ebenfalls die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse. Darüber hinaus hat chromogene Färbung einen schmalen linearen Dynamikbereich, wodurch Signal-Sättigung leicht auftritt, was es schwierig macht, den breiten Dynamikbereich der Proteinexpression in biologischen Proben abzudecken. Daher weist sie Defizite in klinischen Szenarien, die eine genaue Differenzierung niedriger Expressionsniveaus oder strenge Quantifizierung erfordern, auf. Weiterhin kann da, wenn mehrere Marker für kombinierte phänotypische Analysen benötigt werden, oft nur auf den Vergleich von konsequenten Schnitten zurückgegriffen werden, was zu Schwierigkeiten bei genauer räumlicher Lokalisierung und Koexpressionsanalyse aufgrund ungleichmäßiger Zellverteilung oder Gewebverlust führen kann. Um diese Herausforderungen zu adressieren, haben viele klinische Labore schrittweise zur Mehrmarker-Detektion übergegangen, und einige Zentren beginnen bereits kommerzielle Plattformen für Multiplex-Hellfeld-Immunfärbung einzusetzen, um gleichzeitige Analyse von mehr Zielen bei Erhaltung des morphologischen Hintergrunds zu erreichen.

Doppelte Chromogene Immunohistochemie

Die doppelte chromogene Immunohistochemie ermöglicht visuelle Ko-Auswertung durch Färbung von zwei verschiedenen Markern auf demselben Gewebeschnitt, wobei man üblicherweise ein Ziel mit DAB und ein anderes mit Naphthol/Fast Red etc. markiert. Routinemäßige Anwendungen umfassen Ki-67/MART1 Doppel-Färbung zur Auswertung des Proliferationsindex in melanozytären Läsionen, CD3/CD20 Doppel-Färbung zum Vergleich von T/B-Zell-Populationen in Immuninfiltration, AMACR/p63/hochmolekulares Keratin in Prostatabiopsie zur Unterscheidung von Krebs und gutartigen Prostatadrüsen, sowie p40/napsin A oder TTF1/CK5/6 zur Differenzierung von Lungen-Plattenzellkarzinom vom Adenokarzinom. Dennoch weist diese Technik weiterhin offensichtliche Limitationen auf,主要包括 chromogenes Farbüberlappung während Kolo-Kalisation, die dunkle Signale bildet, die schwer zu interpretieren sind, begrenzten Antikörper-Art Quellen (Erfordert Primärantikörper von verschiedenen Arten, um Kreuzreaktionen zu vermeiden) und relativ hohe Detektionskosten. Diese Faktoren begrenzen ihre Anwendung in komplexen pathologischen Bewertungen bis zu einem gewissen Grad.

Immunfluoreszenz

Mit ihrem breiten Dynamikbereich von 5 bis 6 Größenordnungen kann Immunfluoreszenz (IF)-Technologie proteinexpression-Niveaus wahrheitsgetreuer widerspiegeln. Theoretisch ist sie für präzise Quantifizierung (wie HER2-niedrige Expression-Detektion) und Patientenstratifikation für gezielte Therapie besser geeignet als chromogene IHC. Derzeit wird sie hauptsächlich in der klinischen Praxis zur Detektion von Immunreaktiven bei Autoimmunerkrankungen verwendet. Die Popularität in routinemäßigen Pathologie-Laboren ist jedoch noch durch viele Faktoren begrenzt, einschließlich traditioneller Operation in Dunkelkammer-Umgebungen, niedrigen Instrumenten-Standardisierung, fehlendem morphologischem Gegenfärbung-Hintergrund, Autofluoreszenz-Störung in FFPE-Geweben und leichtem Auslöschen von Fluoreszenzsignalen, was Langzeit-Preservation schwierig macht. Obwohl Slide-Digitalisierungstechnologie die Probleme von Operation und Archivierung bis zu einem gewissen Grad gelindert hat, müssen Antikörper-Art-Beschränkungen und Anpassungsfähigkeit an FFPE-Proben noch weiter optimiert werden.

3. Multiplex Immunohistochemische Färbung

Die Multiplex-Detektion als Technologie, die es ermöglicht, zwei oder mehr Marker auf demselben Gewebeschnitt gleichzeitig auszuwerten, insbesondere die Multiplex-Immunfluoreszenz, hat gezeigt, dass sie gegenüber traditionellen Detektionsmethoden in der Tumor-Mikroenvironment-Forschung und Immuntherapie-Ansprechens-Vorhersage ein potenziell überlegenes Potenzial besitzt. Dennoch ihre Translation in klinische Praxis stellt noch viele technische Engpässe dar, einschließlich zeitaufwendiger experimenteller Protokoll-Optimierung und Validierung, begrenzten Antikörper-Quellen derselben Art, räumlichen Hindernis-Effekten durch Antikörper-Wettbewerb, spektralem Überlappung die Anzahl detektierbarer Ziele beschränkend, und Einfluss von Färbungssequenz und Antigen-Retrieving auf Ergebnisse. Zusätzlich verlassen sich komplexe Multiplex-Daten oft auf professionelle digitale Bildanalyse für effektive Interpretation. Diese Faktoren gemeinsam schränken ihre breite Anwendung in routinemäßiger pathologischer Diagnostik ein.

Multiplex Immunofluoreszenz unter Verwendung von Tyramide Signal Amplification

Das Kernprinzip der Tyramide Signal Amplification (TSA)-Technologie teilt Gemeinsamkeiten mit traditioneller IHC, beide verlassen sich auf enzym-verknüpfte sekundäre Antikörper zur Vermittlung von Signal-Transduktion, führen aber innovativ tyramid-verknüpfte Chromogene oder Fluorophore ein. Ihr Kernvorteil kommt aus der Signal-Amplifikationseffekt enzymatischer Reaktionen: wenn HRP-verknüpftes Enzym mit Tyramide reagiert, erzeugt es reaktive freie Radikale, die Chromogene oder Fluorophore dazu bringen, durch kovalente Bindungen stabil an Proteien in der Nähe von Antikörper-Bindungsstellen zu binden. Diese kovalente Bindungseigenschaft erlaubt nachfolgendes Entfernen ungebundener Antikörper durch Eluierungsschritte, wodurch Bedingungen für mehrere Runden von Antikörper-Inkubation und TSA-Signal-Labelling auf demselben Gewebeschnitt geschaffen werden. Basierend auf dieser Eigenschaft verbessert die TSA-Technologie nicht nur signifikant Detektionsempfindlichkeit, besonders geeignet für Detektion von niedrig-häufigen Markern, sondern ermöglicht auch gleichzeitige Detektion mehrerer Ziele durch Kombination von Fluorophoren oder Chromogenen mit verschiedenen Spektren. Diese Technologie ist ähnlich zu konventionellen IHC-Protokollen, kann manuell oder automatisch gefärbt werden, und die meisten klinischen Labore verfügen über grundlegende technische Einrichtungen. Sie ist kompatibel mit frischen/frorzenen und FFPE-Geweben, kann große Gewebeschnitte analysieren, und Fluoreszenzsignale auf Glas-Slides können direkt beobachtet werden für Qualitätskontrolle oder Interpretation, mit mehreren Bildanalyse-Geräten unterstützend Quantifizierung. Dennoch sollte auf Protokoll-Optimierung im experimentellen Bereich geachtet werden, wie Färbungsreihenfolge, TSA-Reagenzien-Dosierung, die Antigenität und räumliche Hindernisse beeinflusst, und Streichungsprotokolle.

Immunhistochemische Zyklus-Färbung

Eine weitere wichtige Multiplex-Färbungsstrategie ist die chromogene IHC-Zyklus-Färbungstechnologie, bei der die weit verbreitetere die Multiplex-IHC auf Einzel-Slide (MICSSS) ist. Ihr technischer Kern besteht darin, das Ziel-Limit einer einzelnen Färbungsrunde durch wiederholte Zyklen von "Färben-Escannen-Chemisch-Farbstoffentfernung" zu durchbrechen. In jedem Zyklus wird der Gewebeschnitt zunächst mit einem spezifischen Marker mittels chromogener IHC gefärbt, dann digital gescannt und archiviert, gefolgt von chemischem Entfernen des chromogenen Substrats und gebundener Antikörper vom Schnitt, und anschließend dem nächsten Zyklus von Färben-Escannen-Farbstoffentfernung für neue Marker. Schließlich werden durch digitale Bildregistrierung und Fusionstechnologie die Scan-Ergebnisse mehrerer Zyklen in ein einzelnes Multi-Farbe digitales Bild integriert. Theoretisch können so 10 oder mehr Marker in einem einzelnen Experiment detektiert werden, was die Informations-Mining-Effizienz eines einzelnen Gewebeschnitts erheblich verbessert, besonders geeignet für Forschungsszenarien, die systematische Analyse von Koexpressionsmustern mehrerer Immunitätszell-Subsets oder Signalweg-Moleküle erfordern. Dennoch stellt diese Technologie signifikante Herausforderungen in klinischer Anwendung dar. Zum einen begrenzt der zeitaufwendige Zyklus-Prozess erheblich Detektions-Durchsatz, was es schwierig macht, die Effizienz-Anforderungen von routinemäßiger klinischer Diagnostik zu erfüllen. Zum anderen führen mehrere Zyklen von Deckglasentfernung, chemischem Farbstoffentfernen und wiederholtem Antigen-Retrieving-Schritten wahrscheinlich zur Degeneration von Gewebe-Antigenität, Zerstörung morphologischer Struktur oder sogar Gewbe-Verschiebung, was nicht nur die Bildqualität einer einzelnen Färbungsrunde reduziert, sondern auch die Genauigkeit mehrerer Runden von Bildregistrierung beeinflusst. Gleichzeitig hat diese Technologie extrem hohe Anforderungen an die Löslichkeit der Chromogene, nur spezifisch lösliche Chromogene können verwendet werden, was den Auswahlbereich von Marker-Detektion begrenzt. Zusätzlich ist das Endergebnis nur ein digitales Multi-Farbe-Scan, kein physikalisches Slide, das langfristig archiviert und wiederholt überprüft werden kann. Weiterhin kann die Expressionsintensität der Marker nur semi-quantitativ bewertet werden, was es schwierig macht, den Bedarf an quantitativen Daten in Präzisionsmedizin zu erfüllen. Diese Faktoren gemeinsam schränken ihre breite Anwendung in routinemäßiger klinischer Diagnostik ein.

Virtuelle Multiplex-Technologie

Als eine alternative Lösung, die keine komplexen experimentellen Operationen erfordert, digitalisiert Virtual-Multiplex Ganz-Slide-Bilder von Einzel-chromogener IHC-Färbung aus konsekutiven Schnitten von Proben, erzeugt Multi-Farbe digitale Sektionen durch Software-Registrierung und Fusion für visuelle Bewertung oder digitale Analyse. Diese Technologie basiert auf bestehenden Laboratorien-Färbungsprotokollen, vermeidet die technischen Herausforderungen realer Multiplex-Färbung. Pathologen können Regionen von Interesse auf H&E-gescannten Schnitten lokalisieren und schnell wechseln, um Multiplex-IHC-Färbung-Ergebnisse derselben Region zu sehen. Dennoch ist diese Technologie im Wesentlichen noch durch die physikalischen Eigenschaften von konsekutiven Schnitten begrenzt. Aufgrund unvermeidlichen Zellverlusts und Verschiebung zwischen Schnitten ist es schwierig, die räumliche Korrespondenz verschiedener Ziele präzise abzugleichen, wodurch wahre Kolo-Kalisation-Analyse unmöglich wird. Zusätzlich, wenn eine große Anzahl von Sektionen benötigt werden, stellt sie das Risiko des Gewebeverbrauchs dar, was zu offensichtlichen Limitationen in komplexen pathologischen Bewertungen, die auf präziser räumlicher Information basieren.

Die Interpretationsmethoden von Multiplex-Bildern werden in direkte visuelle Interpretation und digitale Analyse unterteilt. Direkte visuelle Interpretation ist für einfache Aufgaben wie Tumor-Immunitätsphänotyp-Analyse geeignet. Niedrig-Multiplex chromogene IHC kann durch Glas-Slides interpretiert werden, während Multiplex-IF digitale Schnittinterpretation erfordert und sich auf digitale Bildanalyse-Technologie verlassen muss. Dieser Prozess beginnt üblicherweise mit spektralem Unmischen, um Fluoreszenz-Kreuztalk zu eliminieren, und fokussiert den Analysebereich durch Definition von Regionen von Interesse. Anschließend wird Datenextraktion hauptsächlich durch zwei Kern-Algorithmen durchgeführt: einer ist morphologie-basierte Zell-Segmentierung, die Kern-Färbungen verwendet, um einzelne Zellen zu identifizieren, und kombiniert Membran- oder Zytoplasmatische Signale für Phänotyp-Klassifizierung, geeignet für Zellzählung und Nachbarschaftsanalyse. Der andere ist Kompartimentalisierungsanalyse basierend auf molekularen Eigenschaften, die Proteinexpression in spezifischen subzellulären Strukturen oder extrazellulärer Matrix durch Pixel-Intensität bewertet, unabhängig von vollständiger Zellmorphologie. Dennoch stellt digitale Analyse weiterhin viele Herausforderungen dar, einschließlich nicht-spezifischem Hintergrund-Signal-Störung, Fehlern bei Zell-Segmentierungs-Algorithmen beim Umgang mit unregelmäßigen Zellen oder nicht-sektierten Kernen, und Limitationen pixel-basierter Analyse bei Unterscheidung einzelner Zellen. Diese Faktoren können die Genauigkeit der endgültigen quantitativen Ergebnisse beeinflussen.

4. Zusammenfassung

Obwohl Multiplex-Detektions-Technologie noch in ihrer Infanz ist in klinischen Anwendungen, ihr enormes Potenzial bei Tumor-Diagnose-Klassifizierung und Immuntherapie-Prognose-Bewertung treibt die Entwicklung dieses Feldes an. Besonders in prognostischer Analyse wurden Multiplex-Kombinationen zentriert auf PD-1/PD-L1 und Immunitätszell-Markern klinisch validiert und werden voraussichtlich zu Begleit-Diagnostik-Werkzeugen zur Führung von Immuntherapie.

Referenzen

Harms PW, Frankel TL, Moutafi M, Rao A, Rimm DL, Taube JM, Thomas D, Chan MP, Pantanowitz L. Multiplex Immunohistochemistry and Immunofluorescence: A Practical Update for Pathologists. Mod Pathol. 2023 Jul;36(7):100197. doi: 10.1016/j.modpat.2023.100197. Epub 2023 Apr 25. PMID: 37105494.

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