TSA-mIF für zeitnahe Analyse

TSA-mIF für TIME-Analyse

Hintergrund

Die Interaktion zwischen Krebs und dem Wirtsimmunsystem findet hauptsächlich im reaktiven Gewebestroma um Tumoren herum statt, einem Bereich, der als Tumor-Immunitäts-Mikroumgebung (TIME) bezeichnet wird. Der Durchbruch klinischer Anwendungen von Immuncheckpoint-Inhibitoren, insbesondere zielgerichteter Therapien gegen Programmiertes Todesprotein 1 (PD-1, ein T-Zell-Co-Inhibitor-Rezeptor) und Programmierter Todes-Ligand 1 (PD-L1, auch bekannt als B7-H1/CD274), hat die Krebsimmuntherapie nicht nur in eine neue Ära geführt, sondern auch die funktionelle Analyse der TIME zu einem Kernfokus sowohl im Forschungs- als auch im klinischen Bereich gemacht. Eine präzise Charakterisierung des zellulären Zusammensatzes, der funktionalen Zustände und molekularen Interaktionsnetzwerke der TIME ist eine entscheidende Voraussetzung für das Screening prädiktiver Biomarker für die Immuntherapie-Antwort. Darüber hinaus kann eine tiefgreifende Aufklärung der dualen pro-krebs/anti-krebs-Mechanismen verschiedener Immunzellen in der TIME sowie ihrer dynamischen Assoziation mit Tumorzellen einen Kernstützpunkt für die Entwicklung neuartiger immuntherapeutischer Strategien bieten. Die hohe Heterogenität der TIME und die Herausforderung, geringe Abundanzen an Immunmolekülen zu detektieren, stellen jedoch schwerwiegende Probleme für traditionelle analytische Techniken dar, was dringend hochsensitive, multiplex-zielgerichtete in-situ-Detektionswerkzeuge erfordert, um dieses Dilemma zu überwinden.

                                                                               Tumor-Mikroumgebung (TME)^[1]

Vorteile

Seit über einem Jahrhundert war die Hämatoxylin-Eosin-Färbung (HE-Färbung) das klassische Verfahren für Pathologen, um Lymphozyten, Krebszellkerne, Drüsen und andere Gewebestrukturen in Biopsie- und Operationsmustern unter mikroskopischer Prüfung zu beobachten. Seine morphologischen Merkmale liefern Schlüsselevidenz für die Einstufung und Diagnose der Erkrankung. Die Immunhistochemie (IHC) ist ein routinemäßiges Verfahren zur Analyse klinischer Marker wie Östrogenrezeptoren und Humanen epithelialen Wachstumsfaktor-Rezeptor 2, aber beide weisen offensichtliche Limitationen in der TIME-Forschung auf — die HE-Färbung kann Immunzell-Subsets und funktionelle Moleküle nicht genau identifizieren, und standardmäßige IHC kann nur einen Marker pro Schnitt detektieren, was es schwierig macht, komplexe Merkmale mehrzelliger Interaktionen und molekularer Netzwerke in der TIME zu erfassen. In den letzten Jahren hat die Multiplex-Immunfluoreszenztechnologie (mIF), basierend auf dem Prinzip der Tyramid-Signalverstärkung (TSA), dieses Dilemma vollständig überwunden. Durch die Kernstrategie von "Einzelner Marker-Antikörper-Beschichtung - Senfgelbperoxidase (HRP)-katalysierte kovalente Bindung von Fluoreschin-markierten Tyramid-Molekülen an Ziel-Epitope - Antikörper-Elution für mehrere Runden zyklischer Färbung", kombiniert mit Multispektral-Bildmikroskopie-Scanning und KI-Bildanalyse, kann diese Technologie gleichzeitig 5-10 Marker auf einem einzigen Gewebeschnitt detektieren. Sie kann nicht nur genau Immunzell-Subsets wie CD8⁺T-Zellen, regulatorische T-Zellen und tum-assoziierte Makrophagen identifizieren und eine hochsensitive Detektion von gering-abundanten Immuncheckpoint-Molekülen (wie PD-1/PD-L1) erreichen, sondern kann auch die in-situ-Gewebestruktur vollständig erhalten, die räumliche Proximitätsbeziehung und Interaktionsmuster zwischen Zellen quantifizieren. Sie löst das Problem, dass traditionelle Technologien schwer sind, gleichzeitig mehrdimensionale Informationen von "Zelltypisierung - funktionellem Phänotyp - räumlicher Verteilung" zu erhalten, und bietet eine starke technische Unterstützung für die Analyse der immununterdrückenden Mechanismen der TIME, das Screening von Biomarkern für Immuntherapie-Antworten und die Entdeckung wichtiger Funktionsregionen wie tertiärer lymphoider Strukturen (TLS), wodurch sie zu einem Kernwerkzeug für die Tumourimmunologie-Forschung und die präzise Diagnose-und-Behandlung-Umwandlung wird.

Fälle

Unter Verwendung der TSA-basierten Multiplex-Immunfluoreszenztechnologie haben Maltseva et al. systematisch die TIME-Immunzell-Zusammensetzung und PD-1-Expressionsmerkmale bei Patienten mit Immuntherapie-Antwort und Nicht-Antwort-Gruppen analysiert. Diese Studie ermöglichte eine präzise Identifizierung und Klassifikation von Zellen durch inForm Phänotyp-Analyse-Software, was die Objektivität und Effizienz der Datenanalyse sicherstellte. Das Experiment wählte ein zielgerichtetes Antikörper-Paket einschließlich CD8, PD-1, CD20, CD163 und FoxP3-Antikörpern aus, die zytotoxische T-Lymphozyten, Immuncheckpoint-Moleküle, B-Lymphozyten, pro-tumorale Phänotypische Makrophagen und regulatorische T-Zellen jeweils anvisierten. Kerne wurden mit DAPI angefärbt und behandelt mit anti-Fluoreszenz-Ausblendungs-Medium zur Aufrechterhaltung der Signalstabilität. Während des quantitativen Analyse-Stadiums wurden 10 repräsentative Sichtfelder unter 200x Vergrößerung ausgewählt, und der Prozentsatz der oben genannten Immunzellen in den gesamten Stroma-Zellen innerhalb von Tumorknoten (ausgenommen das umgebende Stroma von Tumorzellen und tertiären lymphoiden Strukturen) wurde berechnet. Durch Mehrfarben-Beschichtung (CD8⁺ Zellen grün, CD20⁺ Zellen gelb, CD163⁺ Zellen rot, Treg-Zellen orange, PD-1 Expression weiß, Kerne blau) wurde das Zell-Infiltrationsmuster visuell dargestellt. Gleichzeitig wurde InForm-Software verwendet, um Einzelmarker-Daten in immunhistochemische Simulationskarten umzuwandeln, um die Ergebnisinterpretation weiter zu unterstützen. Durch die hohe Sensitivität und multiplex Detektionsvorteile der TSA-Technologie zeigte diese Studie klar die Unterschiede im TIME-Immun-Landschaft zwischen Patienten mit unterschiedlichen Therapie-Antwort-Gruppen auf, lieferte direkte experimentelle Evidenz für das Screening von Immuntherapie-Antwort-Biomarkern und bestätigte auch den Kernanwendungswert der TSA-Multiplex-Immunfluoreszenztechnologie in der vertieften Analyse der TIME in klinischen Mustern.

Abbildung 1 Tumoren-Infiltration von CD8 zytotoxischen Lymphozyten, CD20 B-Lymphozyten, FoxP3 regulatorischen T-Zellen, und CD163 Makrophagen in Respondern (A) und Nicht-Respondern (B)^[2].

In einer Studie des Tumoren-Immunitäts-Mikroumgebungs in nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NSCLC), Peng et al. analysierten systematisch die Expressionsmerkmale und Interaktionsbeziehungen von 10 Immunmarkern in Tumornestern (TN) und Tumorstroma (TS) unter Verwendung der Multiplex-Immunfluoreszenztechnologie. Die Ergebnisse zeigten mehrere starke korrelative Immunzell-Interaktionen innerhalb der TIME: stromales CD20⁺ B-Zellen mit stromalem CD4⁺CD38⁺T-Zellen, Neutrophile mit FOXP3⁺ Zellen, stromale Neutrophile mit intratumoralen regulatorischen T-Zellen, intratumorale CD38⁺ T-Zellen mit intratumoralen CD20⁺ B-Zellen, intratumorale CD8⁺ T-Zellen mit intratumoralen PD-L1-exprimierenden M2-Makrophagen und intratumorale PD-L1⁺ Zellen mit intratumoralen CD8⁺ T-Zellen. Darüber hinaus fand die Studie mäßige Korrelationen zwischen intratumoralen CD133⁺ Zellen und intratumoralen M1-Makrophagen, insbesondere M1-Makrophagen, die PD-L1 nicht exprimieren. Dies deutet darauf hin, dass intratumorale Makrophagen möglicherweise eine Rolle bei der Vermittlung von CD8⁺T-Zell-Aussehungs-immunantworten spielen. Durch die multiplex Detektionsvorteile der Multiplex-Immunfluoreszenztechnologie zeichnete diese Studie das TIME-Immun-Landschaft und Zellinteraktionsnetzwerk des NSCLC klar umrissend, lieferte wichtige Referenzen für nachfolgende Mechanismus-Erkundung und therapeutische Ziel-Screening.

Abbildung 2 Expressionsprofile von 10 Immunmarkern in nicht-kleinzelligem Lungenkrebs. Die Abbildung zeigt einzelne und verschmolzene immunfluoreszenz-Bilder sowie pathologische Schnitte^[3].

In einer Tissue-Microarray (TMA)-Studie färbten Mori et al. bronchiale Atemweg-Tumor und Brustkrebs TMA-Muster mit optimierten Multiplex-Immunfluoreszenz-Protokollen (IP1 und IP2). Multispektrale Bild-Demixing und Analyse wurden unter Verwendung von inForm-Software abgeschlossen, während sie "pathologische Ansichten" generierten, die DAB-Färbung simulieren, um die Ergebnisinterpretation zu unterstützen. Unter ihnen kann das IP1-Protokoll gleichzeitig 5 Zelltypen im TME identifizieren (CD3⁺T-Zellen, CD20⁺B-Zellen, CD3⁺FOXP3⁺regulatorische T-Zellen, CD117⁺CK⁻Mastzellen, CK⁺epithelial/tumor Zellen). In Kombination mit Ki67-Färbung kann der Zellproliferationsstatus bewertet werden, und verschiedene Zell-Subsets können durch Ko-Lokalisierung von CD117 und CK unterschieden werden. Das IP2-Protokoll konzentriert sich auf 4 Kernzelltypen (CD3⁺CD8⁻T-Zellen, CD3⁺CD8⁺Zytotoxische T-Zellen, CD68⁺Makrophagen, CK⁺epithelial/tumor Zellen) und integriert PD-1/PD-L1 Immuncheckpoint-Molekül-Detektion, erfolgreich die Ko-Lokalisierungsmerkmale von PD-L1⁺CD68⁺Makrophagen und PD-1⁺T-Zellen in Brustkrebs-Mustern erfassend. Durch die Kombination von standardisierten mIF-Protokollen und TMA-Technologie erreichte diese Studie effizient eine systematische Analyse der TME-Zellzusammensetzung, funktionelle Status und Immunmolekül-Interaktionen in mehreren Arten von Tumormustern, lieferte einen machbaren Pfad für Hochdurchsatz-klinische Muster TIME-Forschung.

Abbildung 3 Menschliche bronchiale Atemweg-Biopsie-Tissue-Microarrays gefärbt unter Verwendung von zwei Multiplex-Immunfluoreszenz-Protokollen, IP1 (a) und IP2 (b)^[4].

Enkilife kann Kunden TSA-Immunhistochemie und Immunfluoreszenz-Schnitt-Analyse-Dienstleistungen bieten, einschließlich positiver Zellanzahl-Analyse, Ko-Lokalisierungsanalyse, Proximitätsanalyse, Zelldichte-Analyse, Tumorzell-Infiltrationsanalyse usw. 

Für Details bitte überprüfen TSA mIHC Kit

Referenzen

1. Rojas F, Hernandez S, Lazcano R, Laberiano-Fernandez C, Parra ER. Multiplex Immunfluoreszenz und der Digitalen Bildanalyse-Arbeitsablauf für die Bewertung des Tumoren-Immunitäts-Umgebungs in Translationsforschung. Front Oncol. 2022 Jun 27;12:889886. doi: 10.3389/fonc.2022.889886. PMID: 35832550; PMCID: PMC9271766.

2. Maltseva A, Kalinchuk A, Chernorubashkina N, Sisakyan V, Lots I, Gofman A, Anzhiganova Y, Martynova E, Zukov R, Aleksandrova E, Kolomiets L, Tashireva L. Vorhersage der Antwort auf Immunzielgerichtete Therapie bei Endometriumkrebs über Tumoren-Immunitäts-Mikroumgebung: Eine Mehrzentrische, Beobachtungsstudie. Int J Mol Sci. 2024 Apr 1;25(7):3933. doi: 10.3390/ijms25073933. PMID: 38612743; PMCID: PMC11011874.

3. Peng H, Wu X, Zhong R, Yu T, Cai X, Liu J, Wen Y, Ao Y, Chen J, Li Y, He M, Li C, Zheng H, Chen Y, Pan Z, He J, Liang W. Profilierung des Tumoren-Immunitäts-Mikroumgebungs von Nicht-Kleinzelligem Lungenkrebs unter Verwendung der Multiplex Immunfluoreszenz. Front Immunol. 2021 Nov 4;12:750046. doi: 10.3389/fimmu.2021.750046. PMID: 34804034; PMCID: PMC8600321.

4. Mori H, Bolen J, Schuetter L, Massion P, Hoyt CC, VandenBerg S, Esserman L, Borowsky AD, Campbell MJ. Charakterisierung des Tumoren-Immunitäts-Mikroumgebungs mit Tyramid-basierten Multiplex Immunfluoreszenz. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 2020 Dec;25(4):417-432. doi: 10.1007/s10911-021-09479-2. Epub 2021 Feb 15. PMID: 33590360; PMCID: PMC7960613.