Literaturvermittlung: Multifrequente fluoreszierende Färbeung von Lungentuberkulose-Läsionen basierend auf TSA

Literatur-Sharing: Multiplexierte Fluoreszenzfärbung pulmonaler Tuberkulose-Läsionen basierend auf TSA

Hintergrund

Mycobacterium tuberculosis (Mtb) ist ein obligater menschlicher Erreger, der Alveolen über Aerosolübertragung betritt und die Bildung primärer Läsionen in residenten alveolären Makrophagen und rekrutierten myeloischen Zellen induziert, welche sich dann in Granulome mit zentraler Nekrose-Eigenschaften entwickeln — dies ist das typische pathologische Merkmal der Tuberkulose. Mtb kann die Wirtsimmunsurveillance innerhalb von Granulomen umgehen und unter Stressbedingungen wie Hypoxie, niedrigem pH-Wert und Nährstoffmangel überleben. Daher ist eine eingehende Analyse der räumlichen Struktur des Gewebes in Läsionen, der Verteilung von Immunitätszell-Subsets und der bakteriellen Besiedlungseigenschaften entscheidend für die Aufklärung der Pathogenese der Tuberkulose und die Bewertung der Wirksamkeit von Interventionsmaßnahmen.

Die konventionellen Forschungsmethoden stoßen auf zwei große technische Engpässe: Erstens haben herkömmliche Immunfluoreszenz-Techniken eine geringe Signalsensitivität und hohes Hintergrundrauschen, wodurch die Detektion von seltenen Antigenen schwierig ist; zweitens begrenzt während der multiplexierten Markierung die Verfügbarkeit von Antikörpern aus verschiedenen Spezies die Anzahl der Marker, und dünne Gewebeschnitte können keine vollständige Charakterisierung der 3D-räumlichen Strukturen erreichen. Darüber hinaus wurde die Rolle struktureller Zellen aus pulmonaler Epithel- und Mesenchym-Linien bei der Bildung von Mtb-anfälligen Mikroumgebungen noch nicht vollständig aufgeklärt, und es besteht eine dringende Nachfrage nach hochsensitiver Bildgebungstechnologie, die gleichzeitig Gewebintegrität, endogene Fluoreszenzreporter-Signale und Kernfärbung bewahren kann. Das optimierte Protokoll, das in der Studie von Lata S et al., mit dem Titel "Protokoll für 3D multiplexierte fluoreszierende Bildgebung von PTB-Läsionen unter Verwendung von Opal-TSA-Farbstoffen zur Signalverstärkung," beschrieben wird, adressiert die oben genannten Bedürfnisse präzise und ermöglicht eine genaue Detektion der Multi-Protein-Markierung in dicken Gewebeschnitten sowie 3D-Rekonstruktion.

Kernmethoden

Das Kernprinzip der TSA-Technologie besteht darin, dass horseradish peroxidase (HRP)-konjugierte sekundäre Antikörper in Anwesenheit von Wasserstoffperoxid die Umwandlung von fluoreszenzmarkierten Tyramiden in aktive Formen katalysieren, welche sich dann kovalent an Tyrosin-Reste nahe den Zielantigenen binden und eine Kaskade der Signalverstärkung erreichen. Die Studie wählte Opal-Farbstoffe als Marker, die im Vergleich zu herkömmlichen fluoreszierenden sekundären Antikörpern die Signalsensitivität deutlich verbessern und es ermöglichen, bei niedriger Laserleistung zu bildgeben, wodurch das Gewebephoto-Bleichen reduziert wird.

Der experimentelle Zyklus beträgt etwa 3 Tage. Der Kernarbeitsablauf beinhaltet die Verwendung von Mtb-infizierten B6.Sst1S-Mäusen als Modell, um Lungengewebe durch perkutane Fixierung zu gewinnen, gefolgt von 4% Agar-Einbettung und Vibratommikrotomie, Antigen-Retrieval durch hitzeinduzierte Behandlung oder Triton X-100-Bearbeitung, Blockierung nicht-spezifischer Stellen mit Wasserstoffperoxid und Antikörperverdünner, dann Abschluss der Mehrfachmarkierung durch Zyklen von primärer Antikörper-Inkubation, HRP-konjugierter sekundärer Antikörper-Inkubation, Opal-Farbstoff-Inkubation, Antikörper-Entfernung und Waschen, gefolgt von Kernfärbung. Schließlich werden Bilder mit einem Konfokalmikroskop erworben, das Anregungs- und Emissionswellenlängen aufweist, die den für die Immunfärbung verwendeten Opal-Farbstoffen entsprechen, und 3D-Rekonstruktion wird mit Imaris 10.1.0 Software durchgeführt.

Wichtige Ergebnisse

1. Erhöhte Signal-Sensitivität und Spezifität, Reduziertes Hintergrundrauschen

Im Vergleich zu herkömmlichen Immunfluoreszenz-Techniken mit sekundären Antikörpern, die mit Fluorophoren konjugiert sind, ist die Signal-Sensitivität der Opal-TSA-Technologie erheblich verbessert. Das linke Panel zeigt Bildgebungsergebnisse des seltenen Antigens TTF1, das mit traditionellem Alexa Fluor 488 markiert wurde, während das rechte Panel dasselbe Antigen zeigt, das mit Opal 570 markiert wurde. Beide wurden mit einem 10× Objektiv bei identischen Expositionparametern erfasst. Aus den Bildern kann deutlich beobachtet werden, dass die konventionelle Technikgruppe auf der linken Seite nur schwaches, diffuses Fluoreszenzlicht einfängt und keine präzise Lokalisierung von Antigen-Expressionsstellen ermöglichen kann; die Opal-TSA-Gruppe auf der rechten Seite zeigt helle, konzentrierte Fluoreszenzsignale, die das Verteilungskontur von TTF1-positiven Zellen genau identifizieren können.

2. Ermöglicht Multiplexierte Markierung mit Antikörpern derselben Spezies, Überwindet Limitierungen der Markierungsquantität

Zunächst konzentrierten wir uns auf die Machbarkeit der Dual-Markierung mit Antikörpern derselben Spezies unter Verwendung von 50μm dicken PTB-Läsions-Lungengewebe-Schnitten als Proben, validiert durch das "Färben - Streifen - Neufärben"-Arbeitsablauf. Ein aus Kaninchen stammender iNOS-spezifischer primärer Antikörper wurde für die Färbung verwendet, entwickelt mit HRP-konjugiertem sekundären Antikörper und Opal 690 Farbstoff; nach Streifen des primär/sekundären Antikörper-Komplexes mit mildem BME/SDS-Streifen-Puffer wurde ein weiterer aus Kaninchen stammender TTF1-spezifischer primärer Antikörper hinzugefügt, gepaart mit HRP sekundärem Antikörper und Opal 570 Farbstoff für die Sekundär-Färbung. Einzelkanal- und verschmolzene Bilder bei niedrigem und hohem Vergrößerungsgrad zeigten, dass die Fluoreszenzsignale von iNOS und TTF1 klare Grenzen ohne Kanal-Kreuztalk besaßen, was beweist, dass das milde Streifenprotokoll den vorherigen Runden von Antikörper-Komplexen vollständig entfernen kann, ohne die bereits kovalent gebundenen Opal-Farbstoff-Signale zu beeinflussen, und direkt die Spezifität und Zuverlässigkeit der Dual-Markierung mit Antikörpern derselben Spezies validiert.

Wir erweiterten dies weiter auf Dreifach- und Vierfach-Markierung, wobei alle primären Antikörper aus Kaninchen stammen und Targets durch Opal-Farbstoffe unterschiedlicher Spektren differenziert werden. Die drei Fluoreszenzsignale wurden verschiedenen Zellpopulationen im Läsionsgewebe zugeordnet ohne Überlappungsinterferenz; die vier Signale entsprachen präzise den Expressionscharakteristiken verschiedener Zelltypen, mit klaren und unterscheidbaren Zielverteilungen in verschmolzenen Bildern. Beide Bildsets demonstrieren, dass dieses Protokoll durch optimierte Streifen- und Färbungszyklen multiplexierte Markierung von mindestens 4 Antikörpern derselben Spezies ermöglichen kann, den Schlüssel-Engpass in konventionellen Techniken löst, wo "Antikörperquelle limitiert die Markierungsquantität," und bietet ein effizientes Werkzeug für Multi-Protein-Co-Lokalisationsanalyse in komplexen Läsionsgeweben.

3. Bewahrt Gewebintegrität und Endogene Signale, Unterstützt 3D Räumliche Struktur Analyse

Optimierter Proben-Vorbereitung und Verarbeitungsabläufe können Gewebintegrität vollständig bewahren, endogene Fluoreszenz-Reporter-Signale und Kernfärbung unterstützen, was die 3D-räumliche Strukturanalyse ermöglicht.

Das obige fokussiert auf die Kompatibilität endogener Fluoreszenz-Reporter-Systeme mit Opal-TSA multiplexierter Immunfluoreszenz-Bildgebung. Unter Verwendung von anti-GFP Antikörper-Färbung zeigten Ergebnisse, dass endogene YFP-Reporter-Signale vollständig mit Antikörper-Färbungs-Signalen ko-lokalisierten, was beweist, dass das Protokoll endogene Fluoreszenz-Protein-Aktivität bewahren kann, ohne die Antikörper-Detektion zu beeinträchtigen. Verschmolzene Bildgebung von anti-TTF1 Antikörper mit bakteriellen Reporter-Signalen und YFP-Signalen präsentierte klar die räumlichen Verteilungsbeziehungen von Immunzellen, Bakterien und pulmonalen Epithelialzellen. Unter Verwendung von B6.Sst1S-Mäusen ohne IFN β-YFP-Reporter-Gene als negative Kontrollen wurden nur bakterielle Dual-Fluoreszenz-Signale detektiert, mit keiner unspezifischen YFP-Fluoreszenz, was die Spezifität endogener Signale validiert.

Unter Verwendung von 50μm dicken PTB-Läsions-Lungengewebe-Schnitten als Proben, mit p63 Antikörper-Markierungs-Targets, präsentieren wir einen Vergleich zwischen 2D-Konfokalen Bildern und 3D-rekonstruierten Bildern. A zeigt ebene 2D-Bilder, die nur Zielverteilungscharakteristiken auf einer einzigen Ebene anzeigen können; B zeigt 3D-Bilder rekonstruiert aus der Z-Stack-Sequenz dieses Schnitts unter Verwendung von Imaris 10.1.0 Software, intuitiv präsentierte dreidimensionale Cluster-Morphologie p63-positiver Zellen in Läsionsgeweben. Durch direkten Vergleich der beiden Bildgebungsmodi werden die Vorteile dicker Gewebeschnitte kombiniert mit 3D-Rekonstruktionstechnologie hervorgehoben, zeigend, dass im Vergleich zu 2D-Ebenbildgebung sie mehr umfassend und dreidimensional die räumliche Heterogenität von Läsionsgeweben widerspiegeln können.

4. Alternativmethode zur traditionellen Hitze-induzierten Antigen-Retrieval

Unter Verwendung von 50μm dicken PTB-Läsions-Lungengewebe-Schnitten als Proben verglichen wir das Zell-Permeabilisierungsprotokoll von 2% Triton X-100-Inkubation bei Raumtemperatur für 1 Stunde mit traditionellem hitze-induziertem Antigen-Retrieval (HIER, Tris/borate/EDTA-Puffer-Inkubation bei 95°C für 30 Minuten). Validierung durch p63 Einzel-Label-Bildgebung bei niedrigem und hohem Vergrößerungsgrad sowie Sox2 und Krt14 Dual-Label-Färbung zeigten, dass beide Protokolle präzise Antigen-Lokalisierung und spezifische Detektion erreichten. Darüber hinaus passt die Triton X-100-Gruppe nicht nur an das multiplexierte Markierungsarbeitsablauf an, sondern vermeidet auch Gewebefragilität und Schrumpfungsprobleme verursacht durch hohe Temperaturen in HIER. Dies demonstriert, dass das milde Permeabilisierungsprotoll Detektionseffekte erreichen kann, die traditionellen HIER vergleichbar sind, während gleichzeitig dickeres Gewebeintegrität besser bewahrt wird, was eine praxistauglichere Alternative für Immunfärbung von dickem Gewebe bereitstellt.

Zusammenfassung

Diese Studie optimierte Opal-TSA-Technologie systematisch und etablierte ein 3D multiplexiertes fluoreszierendes Bildgebungsprotokoll geeignet für dickes Lungengewebe aus Mtb-infizierten Mäusen. Die Kernvorteile umfassen hohe Signal-Sensitivität, Multiplex-Markierungsfähigkeit mit Antikörpern derselben Spezies, Bewahrung von Gewebintegrität und Endogenen Signalen sowie klare 3D-räumliche Strukturanalyse. Dieses Protokoll kann die räumlichen Verteilungsbeziehungen zwischen Immunzellen und strukturellen Zellen in PTB-Läsionen genau analysieren, sowie den Überlebens- und Replikationsstatus von Mtb in Läsionen, was ein Schlüsselinstrument für Aufklärung der Rolle pulmonaler Struktur-Zellen bei der Bildung von Mtb-anfälligen Mikroumgebungen bereitstellt und die molekularen Mechanismen der Tuberkulose-Progression aufklärt. Zusätzlich ermöglicht die hohe Sensitivität des Protokolls schnelle Screening von Regionen von Interesse, was die Effizienz nachfolgender hochauflösender Bildgebung verbessert und die Entdeckung von Interventionszielen beschleunigt. Diese Technologie löst nicht nur den Schlüsseltechnischen Engpass in PTB-Läsionsanalyse, sondern bietet auch eine wichtige Referenz für räumliche Charakterisierung von Geweben bei anderen Erkrankungen.

Referenzen

Lata S, Yabaji SM, O'Connell AK, Gertje HP, Kirber MT, Crossland NA, Kramnik I. Protokoll für 3D multiplexierte fluoreszierende Bildgebung von pulmonaler TB-Läsionen unter Verwendung von Opal-TSA-Farbstoffen zur Signalverstärkung. STAR Protoc. 2025 Mar 21;6(1):103640. doi: 10.1016/j.xpro.2025.103640. Epub 2025 Feb 20. PMID: 39982826; PMCID: PMC11889971.

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