Wissenschaftliche Verbreitung: Multispektrale Immunfluoreszenz zur Immunanalyse von Tumorenten und zu Forschungen über die zelluläre räumliche Verteilung

Literatur-Sharing: Multiplex-Immunofluorescence zur Analyse des Tumormikromilieus und der zellulären räumlichen Verteilung

1. Forschungs Hintergrund

Obwohl die Tumorimmuntherapie sich rasch entwickelt hat und signifikante Ergebnisse erzielt hat, können maligne Tumore eine immunsuppressive Mikroumgebung konstruieren und so der Immunüberwachung entkommen, was die Behandlungseffektivität erheblich einschränkt. Nach der Entdeckung von Immunkontroll-Molekülen wie PD-1 und CTLA-4 sowie ihrer Rolle bei der Tumorentwicklung hat sich die Aufklärung der Interaktion zwischen Immunzellen und Krebszellen zu einer zentralen Voraussetzung für die Entwicklung neuer Immuntherapien entwickelt. Multiplex-Immunofluoreszenz (mIF) ist eine zuverlässige Hochdurchsatz-Methode, mit der mehrere Biomarker, die von einzelnen Zellen exprimiert werden, direkt beobachtet und die räumlichen Beziehungen dieser Biomarker in verschiedenen Zellpopulationen analysiert werden können – was bei herkömmlichen Immunhistochemie-Techniken (IHC) unmöglich ist. Daher kann das Study „Immuno-profiling and cellular spatial analysis using five immune oncology multiplex immunofluorescence panels for paraffin tumor tissue" mehrere Zellsubpopulationen durch die Kombination sorgfältig ausgewählter Antikörper identifizieren. Das tyramide Signalverstärkung (TSA) manuelle Protokoll wurde als Standardreferenz für die Validierung der Multiplex-Färbung verwendet. Der automatische Färber reduzierte die ursprüngliche 4-5 Tage manuelle Färbungszeit auf 14-17 Stunden und verbesserte gleichzeitig die Färbungskonsistenz. Die Literatur demonstriert den Optimierungsprozess und die Reproduzierbarkeit der automatisierten TSA-Färbung und validiert ihren Anwendungswert in der Tumormikroumgebungsforschung und der Analyse der zellulären Phänotypischen räumlichen Verteilung in einer kleinen Kohorte von nicht-kleinzelligen Lungenkarzinom (NSCLC) Proben.

2. Forschungsmethoden

Formalin-fixierte paraffineingebettete Lungenkarzinom-Kontrollgewebe und humane reaktive Mandelgewebe wurden zur Optimierung und Reproduzierbarkeitsvalidierung von IHC, Single-Immunofluoreszenz und mIF verwendet. Nicht-kleinzellige Lungenkrebsproben wurden als Forschungsobjekte für mIF-Färbung und Analyse eingesetzt. Zunächst wurden immunhistochemische und single-immunfluoreszenzbedingungen für Marker wie CK, PD-L1 und CD3 unter Verwendung eines automatisierten Färbesystems optimiert, und 5 immuno-onkologische Multiplex-Immunofluoreszenz-Panels basierend auf dem Tyramide Signalverstärkungssystem wurden konstruiert. Ein effizientes Workflow wurde mit Opal Fluoreszenzfärbungen und einem automatisierten Färber etabliert, was die Färbungszeit verkürzte und die Konsistenz verbesserte. Anschließend wurden NSCLC-Proben mit mIF gefärbt, mittels des Vectra-Polaris 3.0.3 Multispektral-Imaging-Systems gescannt, Bereiche von Interesse durch Pathologen ausgewählt und InForm Software zur Zellsegmentierung, Phänotypquantifizierung und Kollokalisationsanalyse verwendet. Mehrfachdaten wurden mit R-Skripten integriert, technische Reproduzierbarkeit wurde mittels Spearman-Korrelationskoeffizienten und Variationskoeffizient bewertet, zelluläre räumliche Verteilungsmuster wurden durch Vergleich des nächsten Nachbarn Distanz G-Funktion mit theoretischer Poisson-Funktion analysiert, und Datenkorrelationen wurden durch Assoziation mit klinisch-pathologischen Merkmalen der Patienten erforscht.

3. Forschungsergebnisse

NSCLC Multiplex Immunofluorescence

Multiplex-Immunofluoreszenz-Bilder verschiedener immuno-onkologischer Panels und Verbindungskarten von markerkollaborativ exprimierenden Zellen in nicht-kleinzelligen Lungenkrebsgewebeproben, verwendet, um zelluläre Phänotypische Vielfalt darzustellen.

NSCLC Tumormikroumgebung Charakterisierung

Das linke Diagramm ist eine grafische Darstellung verschiedener zellulärer Phänotyp-Cluster, die durch fünf Multiplex-Immunofluoreszenz-Panels erhalten wurden. Jeder Cluster repräsentiert eine Zellsubpopulation mit einem spezifischen Markerkollaborationsmuster, und der Unterschied zwischen verschiedenen Clustern spiegelt die Vielfalt der zellulären Phänotypen wider. Diese Visualisierungsmethode kann intuitiv die Anreicherungsniveaus und Interbeziehungen verschiedener Zellsubpopulationen im Tumormikroumgebung widerspiegeln. Zum Beispiel können einige immunsuppressionsbezogene Zellphänotypen dichtere Cluster bilden, während Effektor-T-Zell-bezogene Phänotypen eine andere Art von Clustering-Eigenschaft aufweisen könnten. Die rechte Seite listet klar die zellulären Phänotypen auf, die durch die fünf mIF-Panels erwartet werden sollten, die basierend auf den Markerkombinationen jedes Panels vordefiniert sind. Es umfasst maligne Zell-CK+ bezogene Phänotypen, T-Zell Subpopulation Phänotypen, Makrophagen-bezogene Phänotypen und myeloid-abgeleitete Suppressor-Zell-bezogene Phänotypen und deckt umfassend die wichtigsten Zellpopulationen im Tumormikroumgebung ab.

Untersuchung zellulärer räumlicher Beziehungen in NSCLC

Das räumliche Analyseergebnis-Graph der nicht-kleinzelligen Lungenkrebsproben visualisiert die Distanzbeziehungen zwischen malignen CK+ Zellen und verschiedenen Immunzellphänotypen. Alle Distanzmessungen sind auf CK+ maligne Zellen zentriert, mit einem Radius von 200 Mikrometer, intuitiv unterschiedliche Zellpopulationen nahe und fern von malignen Zellen. Es bietet eine intuitive Grundlage für die Analyse der räumlichen Verteilungseigenschaften und Interaktionen von Zellen im Tumormikroumgebung, klargestellt die relativen Positionen verschiedener Zellen in Tumorgewebe.

Die Abbildung entspricht 5 mIF-Panels, wobei jedes Panel sich auf Distanzbeziehungen zwischen verschiedenen Zellpopulationen konzentriert. Panels 1 und 2 zeigen die Distanzbeziehungen zwischen CK+ malignen Zellen und verschiedenen CD3+T-Zell-Phänotypen (identifiziert durch verschiedene Farbpunkte basierend auf Markerausdruck) und CD68+ Makrophagen. Panel 3 präsentiert die Distanzbeziehungen zwischen CK+ malignen Zellen, die verschiedene Immunkontroll-Marker exprimieren, und CD3+T-Zellen. Panel 4 zeigt die Distanzbeziehungen zwischen CK+ malignen Zellen und CD3+T-Zellen, die verschiedene Immunkontroll-Marker exprimieren. Panel 5 präsentiert die Distanzbeziehungen zwischen CK+ malignen Zellen und verschiedenen CD68+ Makrophagen-Phänotypen sowie anderen myeloid-abgeleiteten Suppressor-Zell-Phänotypen.

Das Study quantifiziert zudem die Median-Nähe von CK+ malignen Zellen und CK+ malignen Zellen, die verschiedene Immunkontroll-Marker exprimieren, zu verschiedenen Immunzellphänotypen in Form eines Heatmaps. Die Farbintensität spiegelt intuitiv die Distanz wider, wobei dunklere Farben nähere Median-Distanzen zwischen Zellen und höhere Interaktionsmöglichkeiten repräsentieren, während helleren Farben größere Entfernungen und geringere Interaktionswahrscheinlichkeiten entsprechen.

Untersuchung zellulärer räumlicher Verteilungsmuster in NSCLC

Durch einzelne nächste Nachbarn-Distanz G-Funktion und theoretische Poisson-Kurve Kartierung wurden die Distanzverteilungsmuster zwischen CK+ malignen Zellen und CD3+T-Zellen analysiert, und die Hauptzellphänotypen, die zu jedem Muster gehören, wurden angezeigt. Sowohl Abbildung a als auch b bestehen aus drei Teilen: Die linke Seite zeigt die Bewertungsrichtlinien und Schwellwerte für das Urteilen von gemischten und nicht-gemischten Mustern, die mittlere zeigt die Verteilungs-Skizze von CD3+T-Zellen und CK+-Zellen, und die rechte Seite zeigt den Vergleichsbereich der nächsten Nachbarn-Distanz G-Funktion und theoretische Poisson-Kurve. Abbildung a zeigt das gemischte Muster-Verteilung von CD3+T-Zellen relativ zu CK+-Zellen, während Abbildung b das nicht-gemischte Muster-Verteilung zeigt. Abbildung c verwendet ein grafisches Modell, um die Interaktionseigenschaften zweier Zelltypen anzuzeigen, wobei hemmende Zellphänotyp-Scores < 10 gemischte Muster zeigen und engere Interaktionen mit malignen Zellen haben. Zytoxische T-Zellen CD3+CD8+ und zytoxische Gedächtnis-T-Zellen CD3+CD8+CD45RO+ haben Scores > 10, zeigen nicht-gemischte Muster und schwächere Interaktionen mit malignen Zellen. Dieser Befund bietet eine wichtige Grundlage für die Analyse von Zellinteraktionsmechanismen im Tumormikroumgebung und ihre Assoziationen mit Tumorprogression.

4. Zusammenfassung

Dieses Study bietet eine technische Lösung für eine effiziente und präzise Analyse des Tumormikromilieus durch Optimierung automatisierter mIF-Panels und Analyse-Workflows, während es potenzielle Ziele wie B7-H4 und OX40 sowie charakteristische räumliche Verteilungsmuster in NSCLC identifiziert und wichtige Grundlagen für die Entwicklung personalisierter Immuntherapie-Strategien bereitstellt. Trotz Einschränkungen wie kleiner Stichprobenumfang und unzureichender Reproduzierbarkeitsvalidierung haben das technische Paradigma und die Forschungsergebnisse, die in diesem Study etabliert wurden, einen wichtigen Referenzwert für Grundlagenforschung und klinische Translation im Bereich der Tumorimmunologie.

Referenzen

Parra ER, Ferrufino-Schmidt MC, Tamegnon A, Zhang J, Solis L, Jiang M, Ibarguen H, Haymaker C, Lee JJ, Bernatchez C, Wistuba II. Immuno-profiling und zelluläre räumliche Analyse unter Verwendung von fünf immuno-onkologischen Multiplex-Immunofluoreszenz-Panels für paraffin Tumor-Gewebe. Sci Rep. 2021 Apr 19;11(1):8511. doi: 10.1038/s41598-021-88156-0. PMID: 33875760; PMCID: PMC8055659.

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