5-Schriteniges Schnellhandbuch zur Auswahl eines Ladenstabilisierungsantikörpers

5-Schritte-Leitfaden zur Auswahl vonLadekontroll-Antikörpern

Ladekontrollprotein, handelt sich in der Regel um ein Protein, das von einem Housekeeping-Gen kodiert wird. Diese Proteine zeigen eine relativ konstante Expression über verschiedene Gewebe und Zellen hinweg und werden häufig als Referenz verwendet, um Änderungen bei den Expressionsniveaus von Zielproteinen zu erfassen.

Ladekontroll-Antikörper dienen als „Benchmark" in Experimenten. Sie werden verwendet, um Unterschiede in der Probenmenge zu kalibrieren und die Stabilität des experimentellen Systems zu bewerten. Die Auswahl eines geeigneten Ladekontroll-Antikörpers ist ein entscheidender Schritt zur Gewährleistung der Datenzuverlässigkeit und besonders wichtig für Forschungserhebungen im Bereich Genexpression, Proteinquantifizierung und andere verwandte Studien an Universitäten. Wie wählt man einen ladekontroll-Antikörper korrekt aus? Die folgenden Punkte können als Referenz dienen.

           GAPDH Rabbit Monoklonaler Antikörper (Cat: AMRe21263)

1. Ursprungsart der Proben

Der erste zu berücksichtigende Faktor ist die Art, aus der sich die experimentellen Proben ableiten. Für Säugetiergewebe oder Zellproben werden Proteine wie β-Actin, Tubulin, GAPDH, Lamin B, PCNA und Na⁺/K⁺-ATPase in der Regel ausgewählt. Für pflanzliche experimentelle Proben können Plant Actin, Rubisco etc. gewählt werden. Es gibt relativ wenig Forschung zu Proben aus anderen Quellen; daher sollten geeignete Proteine als Ladekontrollprotein durch Bezugnahme auf Literaturberichte ausgewählt werden.

2. Molekulargewicht des Zielproteins

Bei der Auswahl eines Ladekontroll-Antikörpers sollte das Molekulargewicht des Zielproteins berücksichtigt werden. Im Allgemeinen ist es notwendig sicherzustellen, dass die Differenz im Molekulargewicht zwischen dem Zielprotein und dem Referenzprotein mindestens 5 kDa beträgt. Zum Beispiel sind β-Actin und GAPDH bei einem Zielproteingewicht von 40 kDa keine geeigneten Wahlmöglichkeiten für Ladekontroll-Proteine zu diesem Zeitpunkt, und Tubulin kann als alternative Ladekontrollprotein betrachtet werden.

3. Expressionsniveau des internen Referenzproteins

Das ausgewählte Ladekontrollprotein muss in den Testproben hoch exprimiert werden. Häufig verwendete Ladekontroll-Proteine werden von Housekeeping-Genen stark exprimiert und sind für die Zellentwicklung und Aufrechterhaltung der Zellviabilität essenziell.

4. Lokalisierung des Zielproteins

Für die Detektion von allgemeinen Proteinen können GAPDH, β-Actin oder β-Tubulin die Anforderungen erfüllen. Wenn jedoch notwendig ist, subzelluläre Organell-Proteine zu detektieren, ist es angemessener, Ladekontroll-Proteine auszuwählen, die spezifisch für die entsprechenden subzellulären Organellen sind, da dies die Genauigkeit des Ladekontrollproteins besser gewährleistet.

5. Wählen Sie Ladekontroll-Proteine, die nicht von experimentellen Variablen beeinflusst werden

a. Wenn Expressionsniveaus über mehrere Gewebe- oder Zellproben hinweg verglichen werden, wird GAPDH vorzugsweise als Ladekontrollprotein verwendet. Als metabolisches Protein zeigt GAPDH eine relativ konstante Expression in lebenden Geweben. Im Gegensatz dazu sind β-Actin und β-Tubulin strukturelle Proteine, und die Zellstruktur variiert über verschiedene Gewebe hinweg (was zu einer inkonsistenten Expression dieser strukturellen Proteine führt, was sie für Vergleiche zwischen verschiedenen Geweben/Zellen ungeeignet macht).

b. In einigen Zellen können Faktoren wie Gewebe-Hypoxie und Diabetes zu einer erhöhten GAPDH-Expression führen, was ihn ungeeignet macht als Ladekontrollprotein.

c. In Experimenten im Zusammenhang mit Zellproliferation ist c-Jun aufgrund seiner eigenen schwankenden Expression nicht geeignet als Ladekontrollprotein (seine Expressionsstufe ändert sich je nach Status der Zellproliferation).

d. Während Apoptose-Experimenten sind Proteine wie TBP und Lamin auch ungeeignet als Ladekontroll-Proteine (ihre Expression ist während des apoptotischen Prozesses oft gestört oder herunterreguliert).

e. Wenn mit induzierten Proben gearbeitet wird oder modifizierte Antikörper detektiert werden (z.B. Phosphorylierte Antikörper), sollten strukturelle Proteine wie β-Actin und β-Tubulin als Ladekontroll-Proteine ausgewählt werden. Ihre Expression wird weniger von Induktion-Behandlungen oder posttranslationalen Modifikationen beeinflusst, was stabile Referenzwerte gewährleistet.

f. Wenn mit verschiedenen Sekretionsproben gearbeitet wird (wie Plasma, Milch, Interstitielle Flüssigkeit etc.), aufgrund des Fehlens intakter Zellstrukturen können nur bestimmte sekretorische Proteine als Ladekontroll-Proteine ausgewählt werden.

Verfahren zum Verwenden von Ladekontroll-Antikörpern in Western Blotting

1. Für die bequemlichkeitsbezeichnete interne Referenz: Fügen Sie den HRP-markierten Ladekontroll-Antikörper während des sekundären Antikörper-Inkubationsschritts hinzu und folgen Sie dem normalen experimentellen Verfahren.

2. Für den konventionellen Ladekontroll Antikörper: Wenn das Molekulargewicht des Zielproteins nicht signifikant vom ausgewählten Ladekontroll Protein abweicht, führen Sie zunächst Antikörper-Inkubation, Farbentwicklung und Detektion für das Zielprotein durch. Anschließend verwenden Sie ein Strip-Puffer, um die Antikörper auf der Membran zu waschen, und führen erneut Antikörper-Inkubation, Farbentwicklung und Detektion für das Ladekontroll Protein durch.

3. Wenn es einen deutlichen Unterschied im Molekulargewicht zwischen dem Zielprotein und dem ausgewählten Ladekontroll Protein gibt, können Sie die Membran nach der Membranübertragung vorfarben. Basierend auf dem Molekulargewicht des Protein-Markers schneiden Sie die Membran in zwei Teile: einer für hochmolekulare Proteine und der andere für niedrigmolekulare Proteine, um das Ladekontroll Protein vom Zielprotein zu trennen. Anschließend inkubieren Sie die beiden Membranstücke mit dem Ladekontroll Protein-Antikörper und dem Zielprotein-Antikörper jeweils.

Felicia  Felicia ist eine technische Support-Spezialistin bei EnkiLife mit umfangreicher professioneller Erfahrung in der Antikörperentwicklung, -optimierung sowie ELISA-Assay-Design und Anwendung. Sie verpflichtet sich dazu, unsere Kunden dabei zu unterstützen, geeignete Antikörperprodukte auszuwählen, ELISA-experimentelle Protokolle zu optimieren und technische Herausforderungen im Prozess zu lösen, wodurch sie den reibungslosen Fortschritt ihrer Life-Science-Forschungsprojekte unterstützen.