Friegerprobenschnitte Immunohistochemie (IHC) Protokoll
1. Einbetten von Gewebe in OCT
Zweck: Gewebeproben mit OCT-Verbindemittel einbetten und einfrieren, um eine spätere Schnittgewinnung und Fixierung zu ermöglichen.
Material:
- Gewebe Proben
- Isopentan
- Trockeneis
- OCT-Verbindemittel
- Einbettungsformen
Vorgehen:
Bereiten Sie einen Metallbehälter vor, füllen ihn teilweise mit Isopentan auf und stellen ihn auf Trockeneis ab. Lassen Sie das Gemisch 5 Minuten abkühlen.
Geben Sie frisches Gewebe in die Einbettungsform und füllen Sie diese mit OCT-Verbindemittel auf. Passen Sie dabei die Ausrichtung des Gewebes an.
Positionieren Sie die Form über dem gekühlten Isopentanbehälter für 10–20 Sekunden, bis der Gewebekuchen opak wird. Vermeiden Sie direkten Kontakt zwischen Isopentan und OCT.
Lagern Sie die gefrorenen Gewebekuchen im Gefrierschrank bei -80°C für zukünftige Verwendung oder bei -20°C für eine kurzfristige Lagerung.
2. Schneiden
Zweck: Das eingebettete Gewebe in dünne Schnitte schneiden und auf Objektträger mounten.
Material:
- OCT-eingebettetes Gewebe
- Mikroskopobjektträger
- Cryostat und Messerblätter
Vorgehen:
Geben Sie das OCT-eingebettete Gewebe in den Kryostaten bei -20°C, um die Temperatur auszugleichen (30 Min bis 1 Std). Bei größeren oder speziellen Gewebetypen die Zeit gegebenenfalls auf 2 Stunden erweitern.
Sichern Sie den gefrorenen Gewebekuchen am Probenträger.
Stellen Sie das Messerblatt des Kryostats ein, stellen Sie eine korrekte Fixierung sicher und wählen Sie einen geeigneten Schneidewinkel.
Trimmen Sie den Gewebekuchen so, dass die Gewebeoberfläche freigelegt wird. Die typische Dicke liegt zwischen 10–30μm.
Schneiden Sie Schnitte mit einer Dicke von 5–20μm (entsprechend der Experimente anpassen). Werfen Sie die ersten, möglicherweise problematischen Schnitte weg.
Übertragen Sie die Schnitte auf Objektträger mittels Pinsel und bereiten Sie sie für die folgenden Fixierungsschritte vor.
3. Fixierung
Zweck: Erhaltung der Gewebemorphologie durch Behandlung mit Fixativmitteln.
Material:
- Gewebe Schnitte
- Puffer (PBS)
- Fixative (10% neutral gepuffertes Formalin, 4% Paraformaldehyd, 100% Aceton oder Methanol)
Vorgehen:
Lassen Sie frisch geschnittene gefrorene Schnitte bei Raumtemperatur 15 Minuten einwirken.
Wählen Sie das geeignete Fixativ basierend auf dem Detektionsziel:
Für Proteine niedrigen Molekulargewichts, Peptide und Enzyme: 10% neutral gepuffertes Formalin oder 4% Paraformaldehyd
Für Proteine hohen Molekulargewichts: 100% Aceton oder Methanol
Für Proteine hohen Molekulargewichts: 100% Aceton oder Methanol
Tauchen Sie Gewebeschnitte in das Fixativ ein und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 15 Minuten.
Waschen Sie die Schnitte dreimal mit PBS, jeweils 3 Minuten lang.
4. Blockierung
Zweck: Reduzierung der Hintergrundfärbung durch Blockierungsschritte.
Material:
- Gewebe Schnitte
- Blockierungslösung (z. B. 2–10% Normalserum)
- Waschpuffer (PBS)
Vorgehen:
Waschen Sie Objektträger dreimal mit PBS, jeweils 3 Minuten lang.
Blockieren Sie die endogene Peroxidase-Aktivität durch Inkubation mit 3% Wasserstoffperoxid für 10 Minuten und Waschen anschließend mit PBS.
Führen Sie Protein-Blockierung durch, indem Sie das Gewebe 30 Minuten lang in der Normalserum-Blockierungslösung inkubieren.
5. Antikörper-Inkubation
Zweck: Färbung des Gewebes mit Antikörpern, entweder mit direkt konjugierten primären Antikörpern oder indirekt über sekundäre Antikörper-Detektion.
Material:
- Antikörperverdünnungspuffer
- Waschpuffer (PBS)
- Konjugierte primäre Antikörper
Vorgehen:
Bestimmen Sie die optimale Verdünnung des Antikörpers nach den Anweisungen des Herstellers und verdünnen Sie ihn im Antikörperverdünnungspuffer.
Geben Sie den verdünnten primären Antikörper auf das Gewebe auf und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 1 Stunde oder über Nacht bei 4°C.
Waschen Sie die Schnitte dreimal mit PBS, jeweils 3 Minuten lang.
6. Chromogener Reaktionsprozess & Mikroskopie
Zweck: Visualisierung der Färbungsergebnisse durch chromogene Reaktion.
Material:
- Chromogenes Substrat (z. B. DAB, AEC)
- Gegenfärbeung (optional, z. B. Hämatoxylin)
- Montagemedium (optional, z. B. wässriges Montagemedium)
- Deckgläser
- Mikroskop
Vorgehen:
Geben Sie die vorbereitete Chromogenlösung auf das Gewebe auf und beobachten Sie unter dem Mikroskop, bis das gewünschte positive Signal erscheint.
Waschen Sie die Schnitte dreimal mit PBS, jeweils 3 Minuten lang.
Geben Sie die Gegenfärbelösung auf die Schnitte auf und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 2–5 Minuten.
Spülen Sie Objektträger mit PBS aus, um überschüssigen Farbstoff und blaues Hämatoxylin zu entfernen.
Tränken Sie eine kleine Menge Montagemedium auf die Objektträger auf.
Stellen Sie Deckgläser vorsichtig über die Schnitte mittels Pinzette, vermeiden Sie Luftblasen.
Untersuchen Sie die Schnitte unter dem Mikroskop oder lagern Sie sie bei 4°C ein, falls nicht sofort beobachtet.
| Jeff Jeff ist ein Experte für Pathologieprodukte bei EnkiLife und spezialisiert auf immunohistochemische Forschung sowie Produktentwicklung seit über 12 Jahren. Er verfügt über ein hohes Maß an Einblick in die Bedürfnisse der Nutzer und engagiert sich dafür, unseren Kunden immunohistochemische Experimente durchzuführen und wissenschaftliche Erkenntnisse zu beschleunigen. |
