Western-Blotting-Protokoll: Gelelektrophorese für Proteine
Das Western Blotting (auch als Immunblotting bezeichnet) ist eine Technik zur Analyse einzelner Proteine in einem Protein-Gemisch (z. B. einem Zelllysat). Beim Western Blotting (Immunblotting) wird das Protein-Gemisch einer Gelelektrophorese in einer Trägermatrix (SDS-PAGE, native PAGE, Isoelektrische Fokussierung, 2D-Gelelektrophorese usw.) zugeführt, um die Proteine nach Größe, Ladung oder anderen Unterschieden zwischen einzelnen Proteinbanden zu trennen. Die getrennten Proteinbanden werden dann auf eine Trägermembran (z. B. Nitrocellulose, Nylon oder PVDF) übertragen. Dieser Prozess wird als Blotting bezeichnet. Die Proteine haften an der Membran in demselben Muster, wie sie getrennt wurden, aufgrund von Ladungswechselwirkungen. Die Proteine auf diesem Immunblot sind dann für die Antikörperbindung zur Detektion zugänglich.
Schlüsselwörter: Biomedizinische Forschung, Protein, Western Blot
Einführung
Das Western Blot wird in der Forschung häufig eingesetzt, um Proteine zu trennen und zu identifizieren. Bei dieser Technik werden Proteinmischungen basierend auf dem Molekulargewicht und damit nach Typ durch Gelelektrophorese getrennt. Diese Ergebnisse werden dann auf eine Membran übertragen, wodurch für jedes Protein ein Band entsteht. Die Membran wird anschließend mit markierten Antikörpern inkubiert, die spezifisch für das Zielprotein sind.
Das nicht gebundene Antikörper wird ausgewaschen und verlässt nur den gebundenen Antikörper an das Zielprotein. Die gebundenen Antikörper werden dann durch Entwickeln des Films detektiert. Da die Antikörper nur an das Zielprotein binden, sollte nur ein Band sichtbar sein. Die Dicke des Bands entspricht der Menge an vorhandenem Protein; somit kann eine Standardkurve die Menge an vorhandenem Protein anzeigen. Das Papier wird zuerst das Protokoll für Western Blot beschreiben, begleitet von Bildern, um den Lesern zu helfen, sowie Theorie, um das Protokoll zu rechtfertigen. Dies wird gefolgt von der theoretischen Erklärung des Verfahrens, und in dem späteren Abschnitt werden Fehlerlösungen für gängige Probleme vorgestellt.
Technik
Zelllyse zur Proteinauswertung
Proteine können aus verschiedenen Arten von Proben extrahiert werden, wie z. B. Gewebe oder Zellen. Im Folgenden ist das Protokoll zum Extrahieren von Proteinen aus anhaftenden Zellen beschrieben.
Anhaftende Zellen:
Waschen Sie die Zellen in der Gewebekulturflasche oder -schale, indem Sie kaltes Phosphat-puffertes Salzwasser (PBS) hinzufügen und leicht schwenken. Geben Sie das PBS weg. (Tipp: Halten Sie das Gewebeschälchen während des gesamten Prozesses auf Eis).
Fügen Sie PBS hinzu und verwenden Sie einen Zellscraper, um die Zellen zu lösen. Pipettieren Sie das Gemisch in Mikrozentrifugenschläuche.
Zentrifugieren Sie bei 1500 U/min für 5 Minuten und geben das Überstand weg.
Fügen Sie 180 μL kalten Zelllyse-Puffer mit 20 μL frischem Protease-Inhibitor-Cocktail hinzu. (Tipp: Wenn die Protein-Konzentation am Ende nicht hoch genug ist, wird empfohlen, das Verfahren mit einem höheren Anteil an Protease-Inhibitor-Cocktail wiederholt durchzuführen).
Inkubieren Sie für 30 Minuten auf Eis und klären Sie das Lysat durch Drehen für 10 Minuten bei 12.000 U/min, bei 4°C.
Übertragen Sie das Überstand (oder die Proteinmischung) in ein frisches Rohr und lagern auf Eis oder gefroren bei -20°C oder -80°C.
Bestimmen Sie die Konzentration des Proteins mit einem Spektralphotometer.
Probenpräparation
Bestimmen Sie das Volumen des Proteinextrakts, um sicherzustellen, dass 50 μg in jedem Loch vorhanden sind.
Fügen Sie 5 μL Probenpuffer zur Probe hinzu und gleichen Sie das Volumen in jedem Kanal aus, indem Sie destilliertes H2O (dd H2O) verwenden. Gut mischen. (Tipp: Ein Gesamtvolumen von 15 μL pro Kanal wird empfohlen).
Erhitzen Sie die Proben mit dem Trockenblech für 5 Minuten bei 100°C.
Gelepräparation
Nach der Zubereitung der 10%igen Stapelgele-Lösung montieren Sie das Gestell für die Gelezementierung [Abbildung 1]. (Tipp: 10% AP und TEMED festigen die Lösung; daher können beide Gele gleichzeitig vorbereitet werden, wenn die oben genannten Reagenzien erst am Ende hinzugefügt werden).
Fügen Sie die Stapelgele-Lösung sorgfältig hinzu, bis der Pegel gleich dem grünen Balken ist, der die Glasplatten hält [Abbildung 2]. Fügen Sie H2O nach oben hinzu. Warten Sie 15–30 Minuten, bis das Gel fest wird. (Tipp: Die Verwendung einer Saugpipette kann den Prozess des Hinzufügens des Gels zur Glasplatte erleichtern).
Überlagern Sie das Stapelgel mit dem Trennigel, nachdem das Wasser entfernt wurde. (Tipp: Es ist besser, das Gerät zu kippen und ein Papiertuch zu verwenden, um das Wasser zu entfernen).
Fügen Sie den Kamm ein, stellen sicher, dass keine Luftblasen vorhanden sind.
Warten Sie, bis das Gel festgeworden ist. (Tipp: Die Festigung kann leicht geprüft werden, indem man einige Gelelösung in einem Rohr hinterlässt).
Abbildung 1.
Elektrophorese
Gießen Sie den Laufpuffer in die Elektrophoresevorrichtung [Abbildung 3].
Platzieren Sie das Gel in der Elektrophoresevorrichtung und verbinden Sie es mit einer Spannungsversorgung. (Tipp: Wenn Sie die Spannungsquelle anschließen, verbinden Sie immer Rot mit Rot und Schwarz mit Schwarz).
Stellen Sie sicher, dass der Puffer das Gel vollständig bedeckt, und entfernen Sie den Kamm sorgfältig.
Geben Sie Marker (6 μL) gefolgt von Proben (15 μL) in jedes Loch [Abbildung 4].
Führen Sie das Gel mit niedriger Spannung (60 V) für den Trennigel durch; verwenden Sie höhere Spannung (140 V) für das Stapelgel [Abbildung 5a und b].
Führen Sie das Gel für etwa eine Stunde durch, oder bis der Farbstoffvordergrund den Boden des Gels verlässt [Abbildung 6].
Elektrotransfer
Schneiden Sie 6 Filtersätze zum Passen der Messung des Gels und ein Polyvinylidendifluorid (PDVF)-Membran mit denselben Abmessungen.
Feuchten Sie den Schwamm und Filterpapier im Transferpuffer an, und feuchten Sie die PDVF-Membran in Methanol an.
Trennen Sie Glasplatten und holen Sie das Gel heraus.
Erstellen Sie einen Transfer-Sandwich wie folgt:
Schwamm
3 Filterblätter
Gel PVDF
3 Filterblätter
(Tipp: Stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen zwischen dem Gel und der PVDF-Membran vorhanden sind, und drücken Sie die zusätzliche Flüssigkeit aus).
Verschieben Sie das Sandwich in die Transferapparatur, die auf Eis gelegt werden sollte, um 4°C zu halten. Fügen Sie Transferpuffer zur Apparatur hinzu und stellen Sie sicher, dass das Sandwich mit dem Puffer bedeckt ist. Platzieren Sie Elektroden oben auf dem Sandwich, stellen Sie sicher, dass die PVDF-Membran zwischen dem Gel und einer positiven Elektrode liegt [Abbildung 7].
Transfer für 90 Minuten [Abbildung 8]. (Tipp: Die Laufzeit sollte proportional zur Dicke des Gels sein, daher kann dies auf 45 Minuten für 0,75 mm Gele reduziert werden).
Blockierung und Antikörper-Inkubation
Blockieren Sie die Membran mit 5% Magermilch in TBST* für 1 Stunde.
Fügen Sie das primäre Antikörper in 5% Rinderserumalbumin (BSA) hinzu und inkubieren Sie über Nacht bei 4°C auf einem Schüttler [Abbildung 9].
Waschen Sie die Membran mit TBST für 5 Minuten. Machen Sie dies 3-mal. (Tipp: Alle Waschen und Antikörper-Inkubationsschritte sollten auf einem Schüttler bei Raumtemperatur durchgeführt werden, um eine gleichmäßige Agitation sicherzustellen).
Fügen Sie das sekundäre Antikörper in 5% Magermilch in TBST hinzu und inkubieren für 1 Stunde.
Waschen Sie die Membran mit TBST für 5 Minuten. Machen Sie dies 3-mal
Bereiten Sie ECL-Gemisch vor (folgend dem Verhältnis von Lösung A und B, das vom Hersteller bereitgestellt wird). Inkubieren Sie die Membran für 1–2 Minuten [Abbildung 10]. (Tipp: Verwenden Sie eine 1000 μL Pipette, um sicherzustellen, dass ECL den oberen und unteren Teil der Membran bedeckt).
Visualisieren Sie das Ergebnis im Dunkeln [Abbildung 11]. (Tipp: Wenn der Hintergrund zu stark ist, reduzieren Sie die Belichtungszeit).
Rezeptur
Lösen Sie das Folgendes in 800 ml destilliertem H2O auf
8,8 g NaCl
0,2g KCl
3g Tris-Basis
Fügen Sie 500ul Tween-20 hinzu
Stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 ein
Fügen Sie destilliertes H2O zu 1L hinzu
Sterilisieren Sie durch Filtration oder Autoklavierung
Theorie
Probenpräparation
Zelllysate sind die am häufigsten verwendete Form der Probe für Western Blot. Die Proteinauswertung versucht, alle Proteine im Zytosol zu sammeln. Dies sollte bei niedrigen Temperaturen mit Protease-Inhibitoren durchgeführt werden, um eine Denaturierung der Proteine zu verhindern. Da Gewebeproben ein höheres Maß an Struktur aufweisen, ist mechanische Intervention, wie Homogenisierung oder Sonikation, erforderlich, um die Proteine zu extrahieren.
Nach dem Extrahieren des Proteins ist es sehr wichtig, eine gute Vorstellung von der Konzentration des Extrakts zu haben. Dies ermöglicht dem Forscher schließlich sicherzustellen, dass die Proben auf einer äquivalenten Basis verglichen werden. Die Protein-Konzentation wird häufig mit einem Spektralphotometer gemessen. Durch diese Konzentration kann das Gewicht des Proteins bestimmt werden, das in jedes Loch geladen wird, basierend auf der Beziehung zwischen Konzentration, Masse und Volumen.
Nach Bestimmung des geeigneten Volumens der Probe wird diese in einen Lade-Puffer verdünnt, der Glycerin enthält, damit die Proben leicht in die Löcher des Gels sinken. Ein Nachverfolgungsfarbstoff (Bromphenolblau) ist ebenfalls im Puffer vorhanden und ermöglicht dem Forscher zu sehen, wie weit die Trennung voranschreitet. Die Probe wird nach dem Verdünnen in einen Lade-Puffer erhitzt, um die höhere Ordnungstruktur zu denaturieren, während Disulfidbrücken erhalten bleiben. Das Denaturieren der hohen Struktur stellt sicher, dass die negative Ladung von Aminosäuren nicht neutralisiert wird, wodurch das Protein sich in einem elektrischen Feld bewegen kann (angewendet während des Elektrotransfers).
Es ist auch sehr wichtig, positive und negative Kontrollen für die Probe zu haben. Für eine Positive Kontrolle wird eine bekannte Quelle des Zielproteins verwendet, wie z. B. gereinigtes Protein oder ein Kontrolllysat. Dies hilft bei der Bestätigung der Identität des Proteins und der Aktivität des Antikörpers. Eine Negative Kontrolle ist eine Null-Zelllinie, wie z. B. β-Actin, die ebenfalls verwendet wird, um sicherzustellen, dass das Färben nicht unspezifisch ist.
Gelelektrophorese
Western Blot verwendet zwei verschiedene Arten von Agarose-Gel: Stapelgel und Trennigel. Das höhere, Stapelgel ist leicht sauer (pH 6,8) und hat eine niedrigere Acrylamid-Konzentration, wodurch ein poröses Gel entsteht, das Proteine schlecht trennt, aber ermöglicht ihnen, schmale, scharf definierte Banden zu bilden. Das untere Gel, das Trenn- oder Auflösungs-Gel genannt wird, ist basisch (pH 8,8) und hat einen höheren Polyacrylamid-Inhalt, wodurch die Poren des Gels schmaler werden. Proteine werden somit nach ihrer Größe in diesem Gel besser getrennt, da kleinere Proteine leichter reisen und daher schneller als größere Proteine.
Die Proteine, wenn sie auf das Gel geladen werden, haben eine negative Ladung, da sie durch Erhitzen denaturiert wurden, und werden zur positiven Elektrode wandern, wenn eine Spannung angelegt wird. Gele werden normalerweise hergestellt, indem man sie zwischen zwei Glas- oder Plastikplatten gießt, unter Verwendung der Lösung, die im Protokollabschnitt beschrieben ist. Die Proben und ein Marker werden in die Löcher geladen, und die leeren Löcher werden mit Probenpuffer gefüllt. Das Gel wird dann an die Spannungsversorgung angeschlossen und darf laufen lassen. Die Spannung ist sehr wichtig, da eine hohe Spannung das Überhitzen und Verzerrung der Banden verursachen kann.
Blotting
Nach dem Trennen des Protein-Gemischs wird es auf eine Membran übertragen. Der Transfer erfolgt unter Verwendung eines elektrischen Feldes, das senkrecht zur Oberfläche des Gels orientiert ist, wodurch Proteine aus dem Gel heraus und auf die Membran wandern. Die Membran wird zwischen der Gel-Oberfläche und der positiven Elektrode in einem Sandwich platziert. Das Sandwich umfasst ein Faserpolster (Schwamm) an jedem Ende und Filterblätter zum Schutz des Gels und Blotting-Membran [Abbildung 12]. Hier sind zwei Dinge sehr wichtig: (1) der enge Kontakt von Gel und Membran um ein klares Bild sicherzustellen und (2) die Platzierung der Membran zwischen dem Gel und der positiven Elektrode. Die Membran muss so platziert werden, dass die negativ geladenen Proteine aus dem Gel zur Membran wandern können. Dieser Art von Transfer wird als elektrophoretischer Transfer bezeichnet und kann unter halb-trockenen oder nassen Bedingungen durchgeführt werden. Nasse Bedingungen sind in der Regel zuverlässiger, da es weniger wahrscheinlich ist, das Gel auszutrocknen, und wird für größere Proteine bevorzugt.
Die Membran, die feste Unterstützung, ist ein wesentlicher Teil dieses Prozesses. Es gibt zwei Arten von Membranen: Nitrocellulose und PVDF. Nitrocellulose wird wegen seiner hohen Affinität für Protein und seiner Retentionsfähigkeiten verwendet. Allerdings ist es spröde und erlaubt der Membran nicht, um das Blot zu reproben. In diesem Zusammenhang bieten PVDF-Membranen bessere mechanische Unterstützung und ermöglichen das Blot wiederzuverwenden und zu speichern. Jedoch ist der Hintergrund in den PVDF-Membranen höher und daher ist sorgfältiges Waschen sehr wichtig.
Waschen, Blockierung und Antikörper-Inkubation
Blockierung ist ein sehr wichtiger Schritt des Western Blotting, da sie verhindert, dass Antikörper an die Membran unspezifisch binden. Blockierung wird oft mit 5% BSA oder nichtfettigem getrocknetem Milchpulver in TBST verdünnt, um den Hintergrund zu reduzieren.
Nichtfettiges getrocknetes Milchpulver wird oft bevorzugt, da es kostengünstig und weit verbreitet ist. Jedoch sind Milcheiweiß nicht mit allen Detektionsmarkern kompatibel, so dass sorgfältig darauf geachtet werden muss, die geeignete Blockierungslösung zu wählen. Zum Beispiel werden BSA-Blockierungslösungen bevorzugt mit Biotin und AP-Antikörper-Markern sowie Antiphosphoprotein-Antikörpern verwendet, da Milch Kasein enthält, das selbst ein Phosphoprotein und Biotin ist, wodurch die Assay-Ergebnisse beeinträchtigt werden. Es ist oft eine gute Strategie, das primäre Antikörper mit BSA zu inkubieren, da es in der Regel in höheren Mengen benötigt wird als das sekundäre Antikörper. Hinzufügen in BSA-Lösung erlaubt dem Antikörper wiederverwendet zu werden, wenn das Blot kein gutes Ergebnis gibt.
Die Konzentration des Antikörpers hängt von der Anweisung durch den Hersteller ab. Das Antikörper kann in einem Wasch-Puffer, wie z. B. PBS oder TBST, verdünnt werden. Waschen ist sehr wichtig, da es Hintergrund minimiert und nicht gebundenes Antikörper entfernt. Jedoch sollte die Membran nicht zu lange zum Waschen gelassen werden, da sie auch das Signal reduzieren kann.
Die Membran wird dann detektiert, indem man den markierten Antikörper verwendet, normalerweise mit einem Enzym wie Glucose-Oxidase (HRP), das durch das Signal detektiert wird, das es produziert entsprechend der Position des Zielproteins. Dieses Signal wird auf einem Film eingefangen, der normalerweise in einem dunklen Raum entwickelt wird.
Quantifizierung
Es ist sehr wichtig zu wissen, dass die Daten, die mit einem Western Blot erzeugt werden, typischerweise als semi-quantitativ betrachtet werden. Dies liegt daran, dass es einen relativen Vergleich von Protein-Stufen liefert, aber keine absolute Messung der Quantität. Es gibt zwei Gründe dafür; erstens gibt es Variationen in Lade und Transfer-Raten zwischen den Proben in separaten Bahnen, die auf verschiedenen Blots unterschiedlich sind. Diese Unterschiede müssen vor einem präziseren Vergleich standardisiert werden. Zweitens wird das Signal, das durch Detektion erzeugt wird, nicht linear über den Konzentrationsbereich der Proben. Somit sollte da, da das erzeugte Signal nicht linear ist, es nicht verwendet werden, um die Konzentration zu modellieren.
Fehlerlösung
Obwohl das Verfahren für Western Blot einfach ist, können viele Probleme auftreten, die zu unerwarteten Ergebnissen führen. Das Problem kann in fünf Kategorien gruppiert werden: (1) ungewöhnliche oder unerwartete Banden, (2) keine Banden, (3) schwache Banden oder schwaches Signal, (4) hoher Hintergrund auf dem Blot und (5) fleckige oder ungleiche Punkte auf dem Blot.
Ungewöhnliche oder unerwartete Banden können aufgrund von Protease-Degradation entstehen, was Banden an unerwarteten Positionen erzeugt. In diesem Fall ist es ratsam, eine frische Probe zu verwenden, die auf Eis gehalten wurde, oder den Antikörper zu ändern. Wenn das Protein in einer zu hohen Position zu sein scheint, dann kann das Neu-Erhitzen der Probe helfen, um die quaternäre Proteinstruktur zu brechen. Ähnlich sind verschwommene Banden oft durch hohe Spannung oder Luftblasen verursacht, die während des Transfers vorhanden sind. In diesem Fall sollte sichergestellt werden, dass das Gel bei einer niedrigeren Spannung läuft und dass das Transfer-Sandwich richtig vorbereitet wird. Darüber hinaus kann auch das Ändern des Laufpuffers das Problem helfen. Nichtflache Banden können das Ergebnis von zu schnellem Durchgang durch das Gel sein, aufgrund geringer Widerstand. Um dies zu beheben sollte das Gel optimiert werden, um der Probe zu passen. Schließlich sind weiße (negative) Banden auf dem Film aufgrund von zu viel Protein oder Antikörper.
Ein anderes Problem: keine Banden kann auch aus vielen Gründen entstehen, die mit Antikörper, Antigen oder verwendetem Puffer zusammenhängen. Wenn ein unpassender Antikörper verwendet wird, entweder primär oder sekundär, wird das Band nicht zeigen. Darüber hinaus sollte die Konzentration des Antikörpers ebenfalls angemessen sein; wenn die Konzentration zu niedrig ist, kann das Signal möglicherweise nicht sichtbar sein. Es ist wichtig zu bedenken, dass einige Antikörper nicht für Western Blot verwendet werden sollten. Ein weiterer Grund für keine sichtbaren Banden ist die niedrigste Konzentration oder Abwesenheit des Antigens. In diesem Fall kann Antigen aus einer anderen Quelle verwendet werden, um zu bestätigen, ob das Problem bei der Probe liegt oder mit anderen Elementen, wie z. B. dem Antikörper. Darüber hinaus kann auch verlängertes Waschen das Signal verringern. Puffer können ebenfalls zum Problem beitragen. Es sollte sichergestellt werden, dass Puffer wie Transfer-Puffer, TBST, Laufpuffer und ECL alle neu und nicht kontaminiert sind. Wenn die Puffer mit Natriumazid kontaminiert sind, kann es HRP inaktivieren.
Ähnlich können schwache Signale durch niedrige Konzentration von Antikörper oder Antigen verursacht werden. Erhöhen der Belichtungszeit kann auch helfen, um das Band klarer zu machen. Ein weiterer Grund könnte nichtfettiges Trockenmilch sein, das das Antigen maskiert. In diesem Fall verwenden Sie BSA oder verringern die Menge an Milch verwendet.
Hoher Hintergrund wird oft durch zu hohe Konzentration des Antikörpers verursacht, das an PVDF-Membranen binden kann. Ein anderes Problem könnte die Puffer sein, die möglicherweise zu alt sind. Erhöhen der Waschzeit kann auch helfen, um den Hintergrund zu verringern. Zusätzlich kann zu hohe Belichtung ebenfalls zu diesem Problem führen. Daher ist es ratsam, verschiedene Belichtungszeiten zu prüfen, um eine optimale Zeit zu erreichen.
Flecken und ungleiche Punkte auf dem Blot werden in der Regel durch unpassenden Transfer verursacht. Wenn es Luftblasen gibt, die zwischen dem Gel und der Membran gefangen sind, wird es dunkler auf dem Film erscheinen. Es ist auch wichtig, einen Schüttler für alle Inkubation zu verwenden, so dass keine ungleiche Agitation während der Inkubation vorhanden ist. Noch einmal ist Waschen von äußerster Wichtigkeit sowie zum Waschen des Hintergrunds. Dieses Problem kann auch durch Antikörper verursacht werden, die an den Blockierungsagenten binden; in diesem Fall sollte ein anderes Blockierungsagente versucht werden. Filtern des Blockierungsagens kann auch helfen, einige Kontaminanten zu entfernen. Schließlich kann dieses Problem auch durch Aggregation des sekundären Antikörpers verursacht werden; in diesem Fall sollte das sekundäre Antikörper zentrifugiert und gefiltert werden, um die aggregierten zu entfernen.
Fazit
Western Blot ist eine Technik, die sehr nützlich für Proteindetektion ist, da sie dem Nutzer ermöglicht, den Protein-Ausdruck zu quantifizieren sowie. Dieses Papier deckt das Protokoll, die Theorie hinter diesem Protokoll und einige Fehlerlösungstechniken ab. Western Blot kann als eine komplexe Balance gesehen werden, da der Forscher versucht, ein unspezifisches, aber starkes Signal zu erhalten.