Das Escherichia coli-Expressionssystem ist eine Säule der rekombinanten Proteinproduktion und wird aufgrund seiner gut charakterisierten Stoffwechselwege, seines schnellen Zellwachstums, seiner hohen Proteinausbeute und seines klaren genetischen Hintergrunds geschätzt. Trotz dieser Vorteile stellt die Tendenz zur Aggregation von Proteinen zu Inklusionskörpern eine erhebliche Herausforderung bei der Nutzung dieses Systems dar. Diese unlöslichen Aggregate fehlen oft an biologischer Aktivität und stellen für Forscher, die funktionelle Proteine gewinnen möchten, ein beträchtliches Hindernis dar. In diesem Beitrag präsentieren wir fünf wesentliche Strategien zur Verbesserung der Löslichkeit rekombinanter Proteine in E. coli und zur Verringerung der Bildung von Inklusionskörpern.

1. Entfernung von Signalpeptiden

Signalpeptide, die typischerweise 5–30 Aminosäuren umfassen, spielen eine entscheidende Rolle bei der Lenkung neu synthetisierter Proteine durch sekretorische Wege und unterstützen deren Faltung zu spezifischen dreidimensionalen Strukturen. Sie bestimmen zudem die finale Lokalisierung von Proteinen in bestimmten subzellulären Kompartimenten. Im Kontext der intrazellulären Proteinexpression in E. coli sind Signalpeptide oft funktionsredundant und können sogar nachteilig sein. Die hydrophobe Natur von Signalpeptiden kann die Prote aggregierenbildung fördern und zur Bildung von Inklusionskörpern führen. Daher wird empfohlen, Signalpeptide aus der Zielsequenz zu entfernen, um eine lösliche Expression in E. coli zu ermöglichen (Baneyx, 1999).

2. Codon-Optimierung

In der Proteinsynthese lenken tRNAs mit entsprechenden Codons Aminosäuren zur mRNA für die Translation. In prokaryotischen Systemen führt die unterschiedliche Häufigkeit von tRNAs zu einem Codonen-Bias. E. coli enthält acht seltene Codons: AGA, AGG, CGG, CGA, AUA, CUA, GGA und CCC. Wenn das Gen vom Interesse ein Wildtyp-Gen ist, wird empfohlen, zunächst die Häufigkeit von seltenen Codons zu analysieren. Für Gene mit einer niedrigen Häufigkeit an seltenen Codons kann die Nutzung einer Rosetta-Stammexpression die Expression verbessern. Wenn jedoch das Gen eine hohe Frequenz an seltenen Codons aufweist, ist die Kombination aus Codon-Optimierung und Gensynthese der beste Ansatz. Die Codon-Optimierung umfasst die Auswahl von Codons, die häufiger in E. coli verwendet werden (typischerweise solche mit einer Nutzungshäufigkeit >20%). Dieser Prozess kann die Stabilität von mRNA-Zweitstrukturen verbessern und Übersetzungsverzögerungen sowie vorzeitige Termination, Frameshifts und Aminosäure-Missstellungen aufgrund unzureichender tRNA-Pools verhindern (Gustafsson et al., 2004).

3. Auswahl geeigneter Expressionsvektoren

Auch bei einer optimierten Gensequenz ist für die lösliche Proteinexpression der richtige Expressionsvektor erforderlich. Die pET28-Serie ist für verschiedene Proteine weit verbreitet. Der Vektor pET22b kann die Sekretion von Zielproteinen in den Periplasmischen Raum steuern, was die Bildung von Disulfidbrücken und das korrekte Protein-Folding erleichtert und somit die Löslichkeit verbessert. Fusionssysteme wie pGEX4T, pET32 und pET43.1 können ebenfalls die Löslichkeit verbessern, indem sie Fusionstags integrieren, die die Löslichkeit fördern. Darüber hinaus sind die Vektoren der Serien pCold und pBAD hervorragende Optionen zur Optimierung von Proteinexpressionsbedingungen (Rosano und Ceccarelli, 2014).

4. Auswahl geeigneter Expressionsstämme

Nach der Auswahl des passenden Expressionsvektors ist der nächste Schritt die Wahl des richtigen E. coli-Stamms für die Proteinexpression. Der BL21-Stamm wird häufig für Routineproteinexpression verwendet. Der T7E-Stamm kann die Proteinausbeute steigern. Der Origami-Stamm wurde entwickelt, um die Bildung von Disulfidbrücken innerhalb des Zytoplasmas zu fördern. Der Arctic-Stamm ermöglicht eine Induktion bei 12°C, was die Proteinlöslichkeit und -aktivität verbessern kann (Takai et al., 2001).

5. Optimierung der Expressionsbedingungen

Die lösliche Proteinexpression erfordert einen umfassenden Ansatz, der alle Aspekte des Expressionssystems berücksichtigt. Dies umfasst das Testen der Kompatibilität von Expressionsvektoren mit verschiedenen E. coli-Stämmen und die Optimierung der Induktionsbedingungen, wie z. B. die Auswahl des geeigneten Wachstumsmediums, die Anpassung der Induktionstemperatur und die Feineinstellung der Konzentration an Induktoren. Diese Optimierungen können die Bildung von Inklusionskörpern signifikant reduzieren (Baneyx und Mujacic, 2004).

Fazit

Obwohl die Bildung von Inklusionskörpern eine gängige Herausforderung in der E. coli-Proteinexpression ist, ist sie nicht immer ein Nachteil. Inklusionskörper liefern oft hohe Proteinausbeuten und sind einfacher zu reinigen, sodass sie für Anwendungen wie die Antikörperproduktion für Westernblots eine geeignete Wahl darstellen. Für die Gewinnung biologisch aktiver Proteine können jedoch die oben genannten Strategien die Proteinlöslichkeit und -funktionalität signifikant verbessern. Durch sorgfältige Berücksichtigung der Entfernung von Signalpeptiden, der Codon-Optimierung, der Auswahl geeigneter Vektoren und Stämme sowie der Optimierung der Expressionsbedingungen können Forscher die Herausforderungen, die durch Inklusionskörper gestellt werden, wirksam überwinden und eine erfolgreiche Proteinexpression in E. coli-Systemen erreichen.