FAQs zur Antikörper-Herstellung - Tierimmunisierung
Bei der Herstellung von monoklonalen und polyklonalen Antikörpern ist die Tierimmunisierung einer der wichtigsten Schritte. Ihr Ziel besteht darin, das Immunsystem des Tieres zu stimulieren, um spezifische Antikörper gegen das Zielantigen zu produzieren. Die Immunisierungsverfahren für beide Antikörpertypen weisen gewisse Gemeinsamkeiten auf, unterscheiden sich jedoch aufgrund ihrer unterschiedlichen Herstellungsziele auch voneinander.
1. Antigenvorbehandlung
Proteinantigene müssen eine Reinheit von >90 % aufweisen, um Störungen der Immunantwort durch Verunreinigungen zu vermeiden. Für kleine Moleküle oder Polypeptide ist eine Konjugierung mit Trägerproteinen (wie BSA oder KLH) erforderlich; dabei wird KLH in der Regel als erste Wahl betrachtet.
2. Auswahl der Versuchstiere
Für die Herstellung von polyklonalen Antikörpern werden häufig Neuseeländische Kaninchen, Ziegen, Schafe und andere Tiere verwendet. Unter diesen sind Kaninchen aufgrund ihrer moderaten Körpergröße, ihres stabilen Immunanspruchs und der einfachen Blutentnahme am häufigsten gewählt. Für spezifische Antigene können auch Meerschweinchen, Hühner und andere Tiere ausgewählt werden. Für die Herstellung von monoklonalen Antikörpern ist BALB/c-Maus die primäre Wahl für die Immunisierung. Wenn das Antigen eine schwache Immunogenität aufweist, können auch andere Stämme wie Ratten verwendet werden.
3. Adjuvantien und Immunisierungsreagenzien
Die häufig verwendeten Adjuvantien für die Immunisierung sind Freund's Complete Adjuvant (FCA) und Freund's Incomplete Adjuvant (FIA). FCA enthält inaktivierte Mycobacterium tuberculosis und hat einen starken immunstärkenden Effekt. Er wird in der Regel für die Primärimmunisierung verwendet. FIA enthält keine bakteriellen Komponenten, was Entzündungsreaktionen bei Tieren verringert und für nachfolgende Booster-Immunisierungen geeignet ist. Vor der Immunisierung muss das Freund's Adjuvant zuvor vollständig mit dem Antigen emulgiert werden, um stabile Emulsionströpfchen zu bilden und eine Separation zu verhindern.
4. Tierhaltungsumgebung
Die Haltungsbedingungen müssen die Standards der SPF-Klasse erfüllen. Die Temperatur sollte bei 20–25 °C geregelt werden, die Luftfeuchtigkeit liegt zwischen 40 % und 60 %, und das Lichtzyklus wird auf 12 Stunden Licht / 12 Stunden Dunkelheit eingestellt. Die Sterilität von Futtermitteln und Trinkwasser muss sichergestellt werden, um externe Stressfaktoren zu vermeiden, die den Immunisierungserfolg beeinträchtigen könnten.
5. Titration
In der Regel wird nach drei Immunisierungszyklen Blut aus dem Maus-Schwanzstiel oder der Kaninchen-Ohrmarginalvene entnommen, und die Serumantikörpertiter werden mit einem indirekten ELISA detektiert. Sobald der Titer den Standard erfüllt, erfolgt eine Booster-Immunisierung ohne Adjuvant 3–5 Tage vor Zellfusion oder Serumgewinnung, meist durch intraperitoneale oder intravenöse Injektion.
Warum gibt es nach der Immunisierung keinen Antikörpertiter oder einen niedrigen Antikörpertiter?
1. Ob das Molekulargewicht und die Immunogenität angemessen sind: Das Molekulargewicht sollte vorzugsweise nicht unter 20 kDa liegen. Ob kleine Moleküle oder Polypeptide mit einem Trägerprotein konjugiert werden. Bei proteinbasierten Antigenen ist es ratsam, vorher zu überprüfen, ob das Protein durch SDS-PAGE abgebaut wurde.
2. Wenn der Antikörpertiter nach drei Immunisierungszyklen den Standard nicht erfüllt, sollte die Anzahl der Booster-Immunisierungen erhöht werden. Wenn sich der Titer dennoch nicht verbessert, muss das aktuelle Antigendesign, die Antiguenqualität und das Immunisierungsprotokoll neu bewertet werden.
3. Bei subkutaner Immunisierung sollten so viele Punkte und Stellen wie möglich injiziert werden; falls erforderlich, kann dies mit intraperitonealer Injektion und Schwanzvene-Injektion kombiniert werden.
4. Um den Immunitätstitel zu messen, wird in der Regel ein indirekter ELISA verwendet, wobei die Bedingungen für die ELISA-Bestimmung ermittelt werden müssen, wie z. B. die optimale Konzentration des Antigens zur Beschichtung, die Konzentration sekundärer Antikörper und die Empfindlichkeit des Substrats. Für verschiedene Antigenkonzentrationen muss die Bewertung ihrer Wirksamkeit unterschiedlich behandelt werden. Wenn die Antigenschicht-Konzentration zu niedrig ist, kann es zu einem Mangel an Antigen kommen, was zu einem geschwächten oder sogar nicht nachweisbaren Bindungssignal führt; selbst wenn die tatsächliche Antikörperkonzentration nicht niedrig ist, kann dies fälschlicherweise als niedriger Titer interpretiert werden.
Hinweise:
1. Die Immundosis sollte angemessen festgelegt werden, um eine durch zu hohe Dosis verursachte Immuntoleranz zu vermeiden und eine zu niedrige Dosis kann keine effektive Antwort induzieren. Regelmäßige Dosen reichen aus.
2. Der gesamte Prozess der Antigenherstellung, Emulgierung und Injektion sollte in einer sterilen Umgebung durchgeführt werden. Die Operateure müssen sterile Handschuhe und Masken tragen, um eine mikrobielle Kontamination des Antigens oder Infektionen der Tiere zu vermeiden.
3. Innerhalb von 30 Minuten nach der Immunisierung sollte das Tier genau beobachtet werden, um zu prüfen, ob es am Injektionsort Rötungen, Schwellungen, Geschwüre oder Knoten gibt. Veränderungen des Tiernahrungs, Trinkens und Gewichts sollten beobachtet werden, und wenn eine Appetitverminderung oder plötzliche Gewichtsabnahme vorliegt, muss nach Infektionen oder Immunanomalien gesucht werden.
4. Um den Einfluss individueller Tiendifferenzen zu verringern, sollten mindestens 3 Tiere in der Immungruppe sein. Für die Herstellung monoklonaler Antikörper wird das Tier mit dem höchsten Titer für die Zellfusion ausgewählt. Für die Herstellung polyklonaler Antikörper werden Seren aus mehreren Tieren gemischt, um den Einfluss einer geringen Reaktion eines einzelnen Individuums auf das Gesamtergebnis zu vermeiden.
5. Wenn der Antikörpertiter nach der Booster-Immunisierung 3–5 Tage später sein Maximum erreicht, sollte die Blutentnahme oder die Milzentnahme unverzüglich erfolgen, um einen Rückgang des Antikörpertitels aufgrund einer übermäßigen Verzögerung zu verhindern.
Die Kernunterschiede der Immunwirkung verschiedener immunisierter Tiere
Versuchstiere | Eigenschaften und Vorteile | Einschränkungen | Antikörperausbeute | ||
BALB/c Mäuse | Es zeigt eine stabile Reaktion auf die meisten Antigene, kann gezielt hochspezifische IgG1-Antikörper produzieren und verfügt über einen kurzen Immunisierungszyklus sowie einfache Handhabung, was es geeignet macht, den experimentellen Fortschritt zu beschleunigen. Es wird häufig bei der Herstellung monoklonaler Antikörper verwendet. Seine Fusionseffizienz mit Myelomzellen ist extrem hoch; Hybridomklone unterliegen selten Chromosomenverlust und können nach anschließender Subkultur und Kryokonservierung weiterhin stabile Antikörper sezernieren, wodurch das Risiko eines Antibodiesekretionsverlustes verringert wird. | Die Ausbeute an Antikörpern ist gering, wobei pro Blutentnahme nur 0,1–0,2 mL Serum gewonnen werden. Es eignet sich nicht für die Herstellung polyklonaler Antikörper. Die Antikörperkonzentration im Kulturüberstand von Hybridomzellen ist niedrig. Seine Reaktion auf Antigene mit schwacher Immunogenität ist relativ gering, und das Auftreten unspezifischer Klone ist wahrscheinlich. | Gering | ||
Ratte | Die Diversität der B-Zellen ist höher als bei Mäusen, und die Toleranzschwelle für konservierte Antigene sowie schwach immunogene Antigene ist höher. Sie können spezifische B-Zellen effizienter aktivieren, z. B. Ratten, die mit humanen konservierten Proteinen immunisiert wurden, und sind leicht blockierende Antikörper zu gewinnen. Es eignet sich für die Herstellung von immunogenen monoklonalen Antikörpern oder funktionellen Blockierungsassays. Die Proliferationsfähigkeit von Hybridomzellen ist stark, und die Konzentration an Antikörpern im Kulturüberstand kann 50-200 μg/mL erreichen; die Ausbeute an Antikörpern ist bei anschließender Expandierungskultur mehr gewährleistet. | Myelomzellen sind weniger selektiv und die Fusionseffizienz ist niedriger als bei Mäusen. Der Immunisierungszyklus ist länger, die Handhabung ist komplexer als bei Mäusen, und die Kosten für die Haltung von Ratten sind höher als bei Mäusen, sodass der experimentelle Zyklus und die Kosten steigen. Die Serumausbeute ist nicht so gut wie bei Kaninchen. | Mäßig | ||
Kaninchen | Sein Immunsystem ist relativ komplex, die klonale Diversität der B-Zellen ist weit höher als bei Mäusen und Ratten, sodass es mehr antigene Epitope erkennen kann. Darüber hinaus ist seine Intensität der Immunantwort hoch, wobei Serumantikörpertiter Werte von 10⁶–10⁷ erreichen – das Höchste unter den drei Tierarten. Es istgeeignet für Szenarien, bei denen Antikörper mit hoher Spezifität und hoher Affinität benötigt werden, und ist die erste Wahl für die Herstellung polyklonaler Antikörper. | Die Reifegrad der Kaninchen-Hybridom-Technologie ist niedriger als bei Mäusen, es gibt wenige Myelomzelllinien verfügbar, die Fusionseffizienz ist niedrig und Hybridomklone sind weniger stabil und neigen zum Verlust der Antikörpersekretion. Darüber hinaus haben Kaninchen einen langen Immunisierungszyklus, hohe Futterkosten und hohe experimentelle Schwellen- und Kosten. | Hoch | ||
Ziege/Schaf | Die Ausbeute an Antikörpern ist extrem hoch, wodurch es das Tier der Wahl für die großangelegte Herstellung von Mehrkörpermolekülen ist. Ein Blutentnahmenvolumen von bis zu 50-200 mL eignet sich für die industriell orientierte Antikörperproduktion. Die Immunantwort auf makromolekulare Antigene ist stabil, und das Antikörper dauert lange. | Der Immunisierungszyklus ist lang, und die Booster-Immunisierung kann die Wirksamkeit erreichen. Die Futterkosten sind hoch, und professionelle Großtierzuchteinrichtungen sowie Fachpersonal für Blutentnahmen werden benötigt. Die Antikörper-Kreuzreaktivität ist relativ hoch, was zusätzliche Reinigungsoptimierungen für Szenarien mit hohen Spezifitätsanforderungen erforderlich macht. | Sehr hoch |
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