FAQs zur Antikörper-Präparation – Hybridom-Zellen
Im Bereich der monoklonalen Antikörper-Präparation ist die Zellfusion ein entscheidender Schritt zur Gewinnung von Hybridom-Zellen. Ziel ist es, B-Lymphozyten und Myelom-Zellen zu verschmelzen, damit sich das genetische Material beider Zellen neu kombinieren kann. Die so gewonnenen Hybridom-Zellen können nicht nur die Funktion der B-Zellen zur Antikörpersekretion aufrechterhalten, sondern auch die Eigenschaften der unbegrenzten Proliferation von Myelom-Zellen erlangen.
Schritte der Zellfusion
1. Kultur von Myelom-Zellen: Myelom-Zelllinien wie SP2/0, NS0 oder P3 - X63 - Ag8.653 aus der Maus. Zur Kultur wurde RPMI 1640 oder DMEM-Medium mit 10%igem Rinderserum (FBS) bei 37°C und 5% CO₂ verwendet. Für die Kultur sollten Zellen im logarithmischen Wachstumsstadium ausgewählt werden, und die Vitalität sollte mehr als 95% betragen; das Zellmorphologie sollte rund und gut dispergiert sein. Zellen sollten 1-2 Tage vor der Fusion passagiert werden, um eine Alterung der Zellen zu verhindern, und Zellen sollten dreimal mit serumfreiem Medium gewaschen werden, um Komponenten im Serum zu entfernen, die die Fusionswirkung beeinträchtigen könnten.
2. Präparation von Milzzellen: 3-4 Tage nach der letzten Immunisierung, wenn die Anzahl der antigen-spezifischen B-Zellen in der Milz am größten ist, wird das Material zu diesem Zeitpunkt entnommen. Der spezifische Vorgang besteht darin, die Milz des immunisierten Mause unter sterilen Bedingungen zu entnehmen, sie mit Scheren zu schneiden und durch ein 200-Maschenzellsieb zu mahlen, um eine Einzelzell-Suspension zu erhalten. Die Zellsuspension wurde dann bei 1000 U/min für 5 Minuten zentrifugiert. Das Überstand wird abgegossen, die Zellen zweimal mit serumfreiem Medium gewaschen und eine Zellzählung durchgeführt.
3. Zellmischung und Zentrifugation: Mischen Sie Milzzellen und Myelom-Zellen im Verhältnis von 5:1 bis 10:1. Zentrifugieren Sie die gemischte Zellsuspension bei 1000 U/min für 5 Minuten, gießen Sie nach der Zentrifugation den Überstand ab und klopfen Sie dann sanft den Boden des Röhrchens, um das Zellklumpen zu lockern und eine Vermeidung von Zellagglomeration zu gewährleisten, die den anschließenden Fusionseffekt beeinträchtigen könnte.
4. PEG-induzierte Fusion: Vorwärmen Sie 50%iges PEG und serumfreies Medium zunächst auf 37°C. Fügen Sie langsam 1 mL des 50%igen PEGs über 1 Minute bei 37°C zur Zellklumpen hinzu, drehen Sie das Röhrchen sanft rotierend, um zu ermöglichen, dass das PEG die Zellen gleichmäßig kontaktiert. Nach dem Abtropfen lassen Sie es bei 37°C für 1 - 2 Minuten ruhen, eine zu lange Zeit kann den Zellmortalität erhöhen.
5. Beendigung der Fusionsreaktion: Nach Abschluss der Reaktion fügen Sie 10ml DMEM-Medium mit 10%igem FBS hinzu, um die Reaktion zu beenden, fügen Sie langsam von langsam bis schnell nach und füllen Sie alle Reaktionen in 6 Minuten ein. Schütteln Sie das Röhrchen sanft beim Einfügen, um das PEG allmählich zu verdünnen, um seine Toxizität für Zellen zu verringern. Zentrifugieren bei 1000 U/min für 5 Minuten, verworfen den Überstand und suspendieren Sie die Zellen mit vollständigem Medium, das HAT enthält.
6. Plättchen und Screening: Inkubieren Sie die verschmolzene Zellsuspension in einem 96-Well-Zellkulturplättchen, fügend 105 Zellen pro Well, um eine angemessene Zelldichte für das anschließende HAT-Screening sicherzustellen. Platzieren Sie das Kulturplättchen in einem Inkubator konstanter Temperatur eingestellt auf 37°C mit 5% CO₂, und kulturen Sie die Zellen in einem vollständigem Medium, das HAT enthält. Nach dem Kulturieren für 3–7 Tage, saugen Sie ab und werfen Sie den Kulturüberstand weg, dann ersetzen Sie das Medium gemäß dem Zellwachstumsstatus. Nach der Medienersetzung, achten Sie darauf, die Zellmorphologie und das Zellwachstum zu beobachten. Führen Sie ELISA durch, um eine positive Screening-Detektion für Fusion 2–3 Tage später durchzuführen.
Häufige Fragen
1. Wenige Klone nach der Fusion
(1) Unzureichende Zellvitalität ist die primäre Ursache. Die Vitalität der immunisierten B-Zellen kann aufgrund eines schlechten Immunstatus des Tieres oder einer unangemessenen Blutentnahmezeit abnehmen; alternativ können Myelom-Zellen eine verringerte Proliferationskapazität aufgrund von Kontamination während der Kultur oder übermäßiger Passagen erfahren. Beide Szenarien beeinflussen direkt den Erfolgsgrad der Fusion.
(2) Ungleiches Verhältnis der beiden Zelltypen kann ein Faktor sein. In der Regel liegt das optimale Verhältnis von B-Zellen zu Myelom-Zellen zwischen 5:1 und 10:1. Ein übermäßig hohes oder niedriges Verhältnis führt zu unzureichender Interaktion zwischen den Zellen, was dazu führt, dass nicht genügend Hybridom-Zellen gebildet werden.
(3) Details im Fusionsprozess erfordern Aufmerksamkeit. In der häufig verwendeten PEG-Fusion-Methode sind die Qualität und Konzentration von PEG Kern-Einflussfaktoren: unzureichende Reinheit von PEG führt zu Verunreinigungs-Toxizität, übermäßig hohe Konzentration verursacht tödliche Schäden an Zellen, und übermäßig niedrige Konzentration ermöglicht nicht effektiv die Zellmembranfusion. Gleichzeitig kann auch eine unangemessene Temperaturkontrolle während der Fusion Probleme verursachen – übermäßig hohe Temperaturen beschleunigen Zellapoptose, während übermäßig niedrige Temperaturen die Fluidität von Zellmembranen hemmen und den Fusionsprozess behindern.
(4) Problem der Plättchendichte: Es wird empfohlen, dass die Gesamtzahl der Zellen in jeder Well eines 96-Well-Plättchens 105.
2. Keine positiven Klone nach der Fusion detektiert
(1) Unzureichende Empfindlichkeit des Detektionsverfahrens macht es unmöglich, positive Klone mit niedriger Antikörpersekretion zu identifizieren. Zum Beispiel im ELISA-Experiment kann dies auf eine übermäßig niedrige Konzentration des beschichteten Antigens, schlechte Aktivität des enzym-markierten sekundären Antikörpers oder inaktiviertes chromogenes Substrat zurückzuführen sein.
(2) Unzureichende Spezifität des Detektionsverfahrens führt zu Störungen durch Fremdsignale. Das Fehlen korrekt entworfener negativer und positiver Kontrollen kann zu Fehlurteilen bei negativen Ergebnissen führen.
(3) Übermäßig kleine verschmolzene Zellcluster führen zu unzureichender Antikörpersekretion (zu wenig produziertem Antikörper zum Detektieren).
(4) Die wachsenden Zellcluster sind entweder falsch verschmolzene Zellen oder abnormale Zellcluster (die nicht das Ziel-spezifische Antikörper sezernieren und somit nicht als positive Klone identifiziert werden).
3. Positive Signale in allen Wells nach der Fusion detektiert
(1) Unzureichende Spezifität des Detektionsverfahrens und Reagenzien. Zum Beispiel schlechte Spezifität des sekundären Antikörpers, übermäßig hohe Konzentration oder unzureichende Reinheit des beschichteten Antigens, übermäßige Spezifität des chromogenen Substrats, verlängerte Chromogenzeit, oder übermäßig hohe Chromogentemperatur. Daher sollten parallel negative und positive Kontroll-Wellen gleichzeitig während der Detektion eingerichtet werden.
(2) Nährstoff-Anreicherung des Mediums führt zu einer übermäßig langen Überlebenszeit unverschmolzener Zellen, die eine große Menge positiver Antikörper in die Wells sezernieren. Das Medium sollte vor der erneuten Detektion ersetzt werden.
(3) Übermäßige Zellkolonien in jeder Well des Zellplättchens. Die Zellen sollten verdünnt und zu einem neuen Plättchen überführt werden, um dort weiterkultiviert zu werden; sobald sie wachsen, sollte erneut detektiert werden.
4. Langsames Wachstum der verschmolzenen Zellen
(1) Das Kulturmedium, insbesondere das Serum, ist für das Zellwachstum nicht geeignet. Es ist unerlässlich, hochwertiges Serum auszuwählen, das für Hybridom-Wachstum geeignet ist.
(2) Die Kultur-Konsumartikel sind nicht zellfreundlich.
(3) Die Zellen sind kontaminiert, beispielsweise durch Mykoplasma, was manchmal sogar zum Zelltod führen kann.
(4) Einige einzelne Zellen haben spezielle Ernährungsanforderungen, was sie schwierig wachsen lässt oder langsames Wachstum verursacht; jedoch haben sie eine starke Fähigkeit zur Antikörpersekretion, und ein starkes Signal kann auch mit nur wenigen solchen Zellen in einer Well detektiert werden. Dies kann nach der Bestimmung des Titers des Überstands beurteilt werden.
5. Positive Klone werden nach mehreren Runden der Subklonierung negativ
(1) Die Zelllinie ist unrein, und nicht-sezernierende Zellen dominieren. Während des Subklonierungsprozesses können positive Zellen entweder nicht in die Zellwells geimpft werden, oder selbst wenn sie rechtzeitig geimpft werden, wachsen die Klone nicht.
(2) Die Zelllinie ist instabil und neigt zu Chromosomenverlust. Verwenden Sie die Methode der limitierten Verdünnung oder die Einzelzell-Sortierungstechnologie, um mindestens 2–3 Runden der Subklonierung durchzuführen, und prüfen Sie regelmäßig den Antikörpersekretionsgrad und die Spezifität. Eliminieren Sie Klone mit einem schnellen Rückgang des Antikörpertiters oder veränderter Spezifität während der Passage und behalten Sie Zelllinien mit stabiler Sekretionsfunktion bei.
(3) Das Zellwachsums-Umfeld ist ungünstig. Zum Beispiel, wenn versucht wird, Zellen in schlechtem Zustand zu retten, haben viele Zellen bereits eine Degeneration erfahren.
(4) Nach Zellkontamination sind die Zellen ebenfalls wahrscheinlich aufhören Antikörper zu sezernieren; der typischste Fall ist Mykoplasma-Kontamination.
6. Hybridome injiziert in Maus Bauchhöhle produzieren kein Ascites, bilden nur feste Tumore, oder das produzierte Ascites hat keinen Titer
(1) Ein unangemessener Maus-Stamm wird ausgewählt. Abnormale Immunfunktion in der Maus selbst kann eine intraperitoneale Entzündungsreaktion auslösen, die die Ascites-Produktion behindert oder zur Bildung von festen Tumoren führt.
(2) Unzureichende Dosis des Sensibilisators, falsche Injektionsmethode oder übermäßig langer Intervall (mehr als 7–14 Tage) nach der Sensibilisierung führen zu einer schlechten Sensibilisierungswirkung.
(3) Die Anzahl der Zellen, die in die Bauchhöhle injiziert werden, ist unzureichend. Jede Maus sollte pro Injektion 10⁵–10⁶ Zellen erhalten, suspendiert in sterilisiertem PBS oder unvollständigem Medium.
(4) Der Grund für übermäßige Festtumorbildung kann sein, dass während der Injektion das Bauch-Zwischengewebe, Muskel oder Darm durchstochen wird, und die Zellen nicht vollständig in die Bauchhöhle injiziert werden. Die Injektions Technik ist entscheidend.
(5) Das von dem Hybridom produzierte Antikörper bindet spezifisch an ein bestimmtes Molekül im Maus-Körper, was zur Neutralisation des produzierten Antikörpers führt. Das Zielprotein, gegen das solche Antikörper gerichtet sind, hat eine hohe Sequenzhomologie mit den eigenen Protein-Substanzen der Maus.
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Felicia Felicia ist eine technische Support-Spezialistin bei EnkiLife mit umfangreicher professioneller Erfahrung in Antikörper-Entwicklung, Optimierung und ELISA-Assay-Gestaltung und Anwendung. Sie ist bestrebt, unsere Kunden dabei zu unterstützen, geeignete Antikörper-Produkte auszuwählen, ELISA-Experimentelle Protokolle zu optimieren, und technische Herausforderungen im Prozess aufzulösen, wodurch sie den reibungslosen Fortschritt ihrer Life Science Forschungsprojekte unterstützt. |