Multispektrale Immunspezifische Fluoreszenztechnologie (mIHC)

Multiplex-Immunfluoreszenz (mIHC) Technologie

Die traditionelle Pathologie hat sich seit langem als Eckpfeiler der Krankheitsdiagnostik etabliert und stützt sich auf eine qualitative oder semi-quantitative visuelle Untersuchung von Gewebeschnitten, um pathologische Veränderungen zu erkennen. Während die Einzel-Immunhistochemie (IHC) spezifische Biomarker effektiv nachweisen kann, ist sie oft auf einen einzigen Biomarker beschränkt, was ihre Fähigkeit einschränkt, die Komplexität der Gewebeumgebung zu erfassen. Die Einführung von Multiplex-Bildgebungstechnologien wie Multiplex-IHC und Multiplex-Immunfluoreszenz (mIHC) stellt einen revolutionären Fortschritt dar und ermöglicht die gleichzeitige Visualisierung mehrerer Biomarker in einem einzigen Gewebeschnitt. Diese Methoden kombinieren Morphologie mit quantitativen Mehr-Biomarker-Daten und räumlichem Kontext und bieten damit eine umfassendere Sicht auf Zellinteraktionen und Krankheitsmechanismen.

Abbildung 1. Schematische Darstellung des Mechanismus jeder Multiplex-Immunfluoreszenz-Methode^[1]

Brightfield-Multiplex-Färbung IHC

Um mIHC an FFPE-Geweben unter Brightfield-Mikroskopie durchzuführen, können mehrere Chromogene/Enzyme verwendet werden. Zunächst wird ein spezifisches Antikörper an das erste Ziel im Schnitt gebunden, und dann wird eine enzymatische Reaktion eingesetzt, um eine bestimmte Farbe am Bindungsstandort zu erzeugen. Nach dem Waschen von überschüssigen Antikörpern wird ein zweiter Antikörper eingesetzt, um sich an das zweite Ziel zu binden und eine weitere Farbe zu produzieren. Durch Wiederholung dieses Prozesses können verschiedene Ziele mit unterschiedlichen Farben unter einem konventionellen optischen Mikroskop beschriftet werden, die eindeutig der morphologischen Struktur des Gewebes entsprechen. Der größte Vorteil dieses Ansatzes ist seine Intuitivität, die es erlaubt, gleichzeitig die normale Morphologie von Gewbezellen und die Verteilung von Zielen zu beobachten.

Tabelle 1. Typische chromogene Substrate in der Multiplex-Immunhistochemie-Detektion^[2]

Obwohl die Brightfield-Multiplex-Beschriftung machbar ist, müssen mehrere Schlüsselfaktoren berücksichtigt werden. Das Kernproblem besteht darin, dass Antikörper entweder mit HRP oder AP konjugiert sein müssen, um Kreuzreaktivität zu vermeiden, was die Multiplex-Fähigkeit direkt einschränkt. Kontinuierliche serielle IHC-Detektion kann zu einer Gewebedegradation führen und die Effektivität der Multiplex-Beschriftung weiter begrenzen. Darüber hinaus besteht das Risiko eines Chromogen-Überlappens, wobei eine Farbe sogar von einer anderen überlagert werden kann, insbesondere wenn sich Chromogen-Spektren überschneiden, was den Einsatz der Brightfield-chromogenen Multiplex-Beschriftung stark einschränkt. Daher ist die Anzahl der Ziele, die stabil detektiert werden können, in der Regel schwerer als 3, und es gibt keinen Signalverstärkungseffekt. Für Ziele mit extrem geringem Gehalt kann die Farbe zu schwach sein, um sichtbar zu sein.

Fluoreszenz-Multiplex-Beschriftung

Um die Einschränkungen der Brightfield-Färbung zu überwinden, entwickelte sich die Fluoreszenz-Multiplex-Beschriftung. Anstatt gefärbte Farbstoffe zu verwenden, werden Antikörper mit Fluorophoren konjugiert. Die Fluorophore für verschiedene Ziele haben unterschiedliche Wellenlängen, und unter einem Fluoreszenzmikroskop emittieren diese Gruppen Licht einzeln. Selbst wenn 5-6 Ziele gleichzeitig beschriftet werden, können ihre Positionen eindeutig unterschieden werden, was sie besonders geeignet macht, um die räumlichen Beziehungen zwischen mehreren Zielen zu beobachten.

Allerdings hat die Fluoreszenzfärbung auch Nachteile. Einerseits ist die Signalintensität der Fluormoleküle selbst begrenzt, und das Fluoreszenzsignal von Zielen mit geringem Gehalt ist immer noch zu schwach. Andererseits können Fluoreszenzsignale unterschiedlicher Wellenlängen durchbluten; beispielsweise kann der Halo des roten Lichts den grünen Lichtbereich abdecken, was zu einer Fehleinschätzung führt. Noch kritischer sind Fluormoleküle anfällig für Photobleaching, was eine schnelle Aufzeichnung während der Beobachtung erfordert, andernfalls das Signal zunehmend schwächer wird.

Die Einführung der Tyramid-Signalverstärkungs- (TSA) Technologie hat eine effiziente Signalverstärkungslösung für die Fluoreszenz-Multiplex-Beschriftung bereitgestellt und viele Einschränkungen, denen traditionelle Technologien ausgesetzt sind, wirksam adressiert. Ihr Kernprinzip besteht darin, dass der Primärantikörper spezifisch an das Ziel bindet und nach der Bindung des an HRP konjugierten Sekundärantikörpers an den Primärantikörper Tyramid-Moleküle, die Fluorophore tragen, in das Reaktionssystem eingeführt werden. Fluoreszenzmarkierte Tyramid-Salze erzeugen unter der Bedingung der HRP-katalysierten Wasserstoffperoxid-Reaktion kovalente Bindungsstellen und lösen dadurch eine große Anzahl von enzymatischen Reaktionen aus. Diese Reaktionsprodukte können sich an umgebenden Proteinen (wie Proteinen mit Tryptophan-, Histidin- und Tyrosin-Resten) binden, wodurch eine große Menge an Fluorophoren am Antigen-Antikörper-Bindungsstandort angesammelt wird, was die Signalintensität um das Zehnfache erhöht und es selbst Zielen mit sehr geringem Gehalt ermöglicht, präzise detektiert zu werden.

Einer der wesentlichen Vorteile der TSA-Technologie ist ihre hohe Spezifität. Die Polymerisationsreaktion von Tyramid-Molekülen ist streng auf den Zielbereich begrenzt, in dem sich HRP befindet, und diffundiert nicht zu anderen unbeteiligten Bereichen, wodurch das Phänomen der Signal-Kreuzinterferenz grundsätzlich eliminiert wird. Gleichzeitig hat das durch TSA-Beschriftung erzeugte Fluoreszenzsignal eine hervorragende Stabilität und eine starke Anti-Auslöschungs-Fähigkeit, was gute Bedingungen für anschließende Beobachtungs- und Bildgebungsaufgaben bietet. Darüber hinaus ist diese Technologie gut kompatibel mit verschiedenen Fluorophoren-Farbstoffen, was den oberen Grenzwert der Anzahl von Zielen für die Fluoreszenzfärbung weiter erweitern kann und bis zu 8-10 Ziele gleichzeitig beschriftet werden lässt, wodurch eine umfassende Detektion mehrerer Ziele in pathologischen Schnitten ermöglicht wird. Auf dem Gebiet der wissenschaftlichen Forschung hilft die TSA-Technologie Forschern dabei, Interaktionsmechanismen zwischen Tumorzellen und Immunzellen klar zu analysieren. In der klinischen Diagnostik kann sie Ärzten helfen, Tumortypen genauer zu identifizieren und einen zuverlässigen experimentellen Hintergrund für die Formulierung von individualisierten Behandlungsplänen bereitzustellen.

Von der Brightfield-Multiplex-Färbung bis hin zur TSA-gestützten Multiplex-Fluoreszenzfärbung hat die Kernstrebestrebe der Multiplex-IHC-Technologie immer darin bestanden, „Ziele deutlicher, sensitiver und genauer zu sehen". Heute ist TSA zu einer unverzichtbaren Schlüsseltechnologie in der Fluoreszenz-Multiplex-Beschriftung geworden. Sie verbessert nicht nur die Empfindlichkeit und Genauigkeit der Zieldetektion erheblich, sondern erweitert auch die Anwendungsszenarien der Multiplex-IHC-Technologie – von der Tumorforschung bis zur Autoimmun-Krankheitsdiagnostik, von der grundlegenden wissenschaftlichen Forschung bis hin zur klinischen Übersetzung. Sie hilft uns dabei, „die biologische Wahrheit hinter Gewebeschnitten" zu durchschauen und stärkere Unterstützung für die Krankheitsdiagnostik und -therapie bereitzustellen.

Enkilife bietet Kunden nicht nur einen kompletten Satz TSA-Multiplex-Beschriftungskits an, sondern stellt auch eine Vielzahl von TSA-Spezialist-Technikdiensten zur Verfügung, einschließlich IF-Fluoreszenzfärbung, Fluoreszenz-Panoramabildgebung, Super-Multi-Marker-Färbung und pathologischer Analyse (5 Marker und darunter). 

Für weitere Details bitte prüfen TSA mIHC Kit

Referenzen

1. Sheng W, Zhang C, Mohiuddin TM, Al-Rawe M, Zeppernick F, Falcone FH, Meinhold-Heerlein I, Hussain AF. Multiplex Immunofluorescence: A Powerful Tool in Cancer Immunotherapy. Int J Mol Sci. 2023 Feb 4;24(4):3086. doi: 10.3390/ijms24043086. PMID: 36834500; PMCID: PMC9959383.

2. Stack EC, Wang C, Roman KA, Hoyt CC. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 2014 Nov;70(1):46-58. doi: 10.1016/j.ymeth.2014.08.016. Epub 2014 Sep 19. PMID: 25242720.