Literaturverbreitung: Multiflokuläre Immunfluoreszenz zur Vorhersage der therapeutischen Wirksamkeit bei frühstattigem Brustkrebs

Literaturteil: Multiplex-Immunfluoreszenz zur Vorhersage der therapeutischen Wirksamkeit bei frühem Brustkrebs IZI therapeutischen Wirksamkeit

Hintergrund

In den letzten Jahren haben Immuncheckpoint-Inhibitoren (IZI) ein Potenzial in der Behandlung von Brustkrebs gezeigt, doch die Therapieergebnisse variieren stark zwischen verschiedenen Patientengruppen. Die Eigenschaften des Tumor-Immun-Mikromilieus (TIME) sind entscheidende Faktoren für die Wirksamkeit von IZI. Derzeit fehlt noch eine systematische und präzise Definition prädiktiver Biomarker für PD-L1-Inhibitor-Therapieergebnisse bei Brustkrebspatienten, insbesondere die Unterschiede in den Mechanismen der Therapieantwort zwischen verschiedenen Rezeptor-Subtypen des Brustkrebs sind nicht vollständig aufgeklärt. Neue Detektionstechnologien, die in jüngster Zeit entwickelt wurden, können mehrere Marker gleichzeitig bewerten und dabei räumliche Zellbeziehungen vollständig erhalten (in situ), und werden zunehmend zur Charakterisierung von Tumor-Immun-Mikromilieus sowie zur Erschließung immunbezogener Biomarker eingesetzt. Unter diesen hat Multiplex-Immunfluoreszenz (mIF) Technologie einen Anwendungswert bei der Vorhersage von IZI-Wirksamkeit in verschiedenen Tumoren gezeigt und deutlich bessere Ergebnisse erzielt als Genexpressions-Signaturen, Tumor-Mutationslast und standardisierte PD-L1-Immunhistochemie-Detektion. Basierend auf diesem Hintergrund analysierte die Studie "Multi-platform biomarkers of response to an immune checkpoint inhibitor in the neoadjuvant I-SPY 2 trial for early-stage breast cancer" (Multiplattform-Biomarker der Reaktion auf einen Immuncheckpoint-Inhibitor im neoadjunktiven I-SPY 2-Versuch für frühen Brustkrebs) die Dichte und räumliche Verteilungscharakteristika von Immunzellen in der Tumorumgebung bei Patienten, die mit neoadjuvanter Chemotherapie ± Pembrolizumab behandelt wurden, mittels Multiplex-Immunfluoreszenz-Detektion. In Kombination mit Genexpressionsprofilierung und Reverse Protein Array Technologie untersuchte sie Immun-Signalwege und Biomarker sowie Wegecharakteristika im Zusammenhang mit DNA-Reparaturdefekten und lieferte somit wichtige Beweise für die klinische Präzisionsauswahl von IZI-bevorzugten Populationen sowie die Optimierung von Immuntherapie-Strategien bei frühem Brustkrebs.

Forschungsmethoden

Das Opal 7-Farb-Fluoreszenz-Immunhistochemie-Kit wurde verwendet, um Multiplex-Immunfluoreszenzfärbungen an 4μm-Abschnitten von prätherapeutischen Formalin-fixierten Paraffin-eingebetteten Tumorgeweben durchzuführen. Der Prozess beinhaltete hitzeinduziertes Epitop-Retrieval (HIER), Inkubation der Primärantikörper, HRP-markierte Sekundärantikörper-Inkubation und Tyramid-Signalverstärkung mit Opal-Fluorophoren-Entwicklung. Anschließend wurden wiederholte Färbungsabläufe nach HIER-Auswaschung gebundener Antikörper durchgeführt, gefolgt von DAPI-Färbung und Einbau. Die Antikörper-Markierungssequenzen wurden basierend auf der Antigen-Stabilität gegenüber wiederholtem HIER bestimmt, und die fluoreszierenden Farbmittel wurden so abgestimmt, dass sie die Färbungsintensität mit der zellulären Lokalisierung balancierten, um Signal-Crosstalk zu reduzieren. Die Abschnitte wurden mittels Vectra 3.0 Scanner abgebildet, wobei pro Tumorbibiopsie-Probe 15-20 Multispektralbilder bei 20x Vergrößerung erfasst wurden. Spektren-Ausmischung und Zellsegmentierung wurden mit inForm quantitativer Pathologie-Software abgeschlossen. Um räumliche Beziehungen zwischen spezifischen Zellphänotypen zu analysieren, setzte diese Studie eine räumliche Punktmuster-Analyse ein, die R-Pakete wie phenoptr, spatstat und divo verwendet. Jedes Multiplex-Immunfluoreszenz-Bild wurde virtuell in nicht überlappende 200μm×200μm-Quadrate unterteilt, und die Anzahl von Krebszellen und Immunzellen innerhalb jedes Quadrates wurde gezählt. Der Morisita-Horn (MH) Ähnlichkeitsindex aus dem divo R-Paket wurde dann verwendet, um das Ausmaß der Ko-Kolokalisation zwischen 21 Gruppen von Zelltypen zu berechnen. Der MH-Index reicht von 0 bis 1, wobei 0 eine hohe Trennung zwischen Zelltyp A und B repräsentiert.

mIF-Identifizierung der Immunzell-Infiltration in Brustkrebs-Gewebe

Die Studie entwickelte zwei Multiplex-Immunfluoreszenz-Detektionspanels zur Analyse der Immunzell-Infiltration in prätherapeutischen Biopsie-Proben. Automatisierte Gating-Algorithmen vollendeten die Zellphänotyp-Identifizierung und generierten Phänotyp-Karten für die anschließende räumliche Analyse. Die Ergebnisse zeigten signifikante Unterschiede in der Immunzell-Dichte zwischen verschiedenen Tumoren, wobei Immunzellen 1%-68% der Gesamtzellen ausmachten. Davon entfielen T-Zellen, B-Zellen und Makrophagen auf < 1%-42%, <1%-22% und <1%-43% jeweils. Signifikante Korrelationen wurden zwischen T-Zellen, B-Zellen und Treg-Dichte festgestellt, während Makrophagen- und Mastzell-Dichte keine Assoziation mit diesen lymphoiden Zellpopulationen zeigten. Zusätzlich zeigten PD-1/PD-L1-Färbungsstufen auch offensichtliche Heterogenität, wobei PD-1+ T-Zellen < 0.04%-3.9% der Gesamtzellen ausmachten und PD-L1+-Zellen < 0.06%-2.6% ausmachten.

Assoziation immunzellbezogener Biomarker mit Therapieantwort

Diese Studie analysierte die vorhersagende Rolle immunzellbezogener Indikatoren auf posttherapeutische pathologische vollständige Antwort (pCR) bei verschiedenen Typen von Brustkrebspatienten in der Pembrolizumab-Behandlungsgruppe und der konventionellen Chemotherapie-Kontrollgruppe. Die Ergebnisse zeigten, dass Indikatoren zur Vorhersage der therapeutischen Wirksamkeit in der Pembrolizumab-Gruppe weit mehr waren als in der Kontrollgruppe, und wirksame prädiktive Indikatoren unterschieden sich zwischen verschiedenen Brustkrebs-Typen. Spezifisch zeigten unter 20 durch Multiplex-Immunfluoreszenz-Technologie detektierten immunzellbezogenen Indikatoren 8 eine signifikante positive Korrelation mit der Pembrolizumab-Therapie-Wirksamkeit, einschließlich tumor-infiltrierender Lymphozyten (TILs), verschiedenen T-Zellen, zwei Arten von PD-L1-expressierenden Zellen und dem PD-L1 CPS Score. Höhere Werte dieser Indikatoren waren mit einer größeren Wahrscheinlichkeit der vollständigen Tumordisparition assoziiert, während in der Kontrollgruppe nur TILs, T-Zellen und B-Zellen schwache Assoziationen mit Wirksamkeit zeigten. Unter den 18 genbezogenen Indikatoren konnten nur 11 die Pembrolizumab-Therapie-Wirksamkeit vorhersagen, was Gen-Signaturen entspricht, die verschiedenen Immunzellen entsprechen, und Gene kodieren für PD-1 und PD-L1. Unter den 11 durch Protein-Detektions-Technologie detektierten immunbezogenen Proteinen war nur das HLADRPQX Protein mit der Pembrolizumab-Therapie-Wirksamkeit assoziiert. Unter den insgesamt 49 immunbezogenen Indikatoren konnten 20 die Immuntherapie-Wirksamkeit klar vorhersagen, während die Kontrollgruppe nur 6 Indikatoren mit unklaren Assoziationen zur Wirksamkeit zeigte. Davon zeigten dendritische Zell-bezogene Gen-Signaturen die beste prädiktive Wirksamkeit, während Mastzell-bezogene Gen-Signaturen eine negative Korrelation mit der Wirksamkeit zeigten. Bei Triple-Negative Brustkrebs konnten 3 Indikatoren die Immuntherapie-Wirksamkeit klar vorhersagen und 8 Indikatoren zeigten bestimmte Assoziationen, hauptsächlich involvierend PD-L1-expressierende Immunzellen und zwei Gen-Signaturen. Bei HR+HER2- Brustkrebs konnten 10 Indikatoren die Wirksamkeit klar vorhersagen und 9 Indikatoren zeigten bestimmte Assoziationen, einschließlich HLADRPQX Protein und verschiedenen Immunzellen. Wichtig ist, dass diese Indikatoren zur Vorhersage der Immuntherapie-Wirksamkeit keine Assoziation mit der Therapie-Wirksamkeit in ihren jeweiligen Kontrollgruppen zeigten.

Korrelation der Immunzell-und Tumorzell-Ko-Kolokalisation mit Pembrolizumab-Reaktion

Die Studie untersuchte räumliche Nähe-Unterschiede zwischen Respondern und Non-Respondern unter verschiedenen Immunzell-Populationen und Tumorzellen oder anderen Immunzellen, mittels MH Index und nearest neighbor Verteilungsfunktion für räumliche Nähe-Analyse. Die Ergebnisse zeigten, dass MH-Index-bezogene Indikatoren signifikant mit der Pembrolizumab-Therapie-Reaktion assoziiert waren und in PD-1/PD-L1-bezogener Zell-Ko-Kolokalisation konzentriert waren, was Subtyp-Spezifität zeigte.

Spezifisch misst der MH Index das Ausmaß der Ko-Kolokalisation zwischen zwei Zelltypen, von 0 bis 1. Wenn zwei Zelltypen hoch kolokalisiert sind, nähert sich der Index 1, und wenn hoch getrennt, nähert er sich 0. Die Studie berechnete MH Indizes für 21 Gruppen von Zelltypen. Hohe MH Indizes zwischen T-Zellen und regulatorischen T-Zellen (Tregs) waren signifikant mit der Pembrolizumab-Therapie-Reaktion in der gesamten Kohorte assoziiert. Hohe MH Indizes zwischen PD-1+ T-Zellen und PD-L1+-Zellen waren auch mit pCR assoziiert. Nach mehreren Test-Korrektur zeigten 8 von 21 MH Indizes eine Assoziation mit der Pembrolizumab-Therapie-Reaktion in der gesamten Kohorte, aber nicht mit der Kontrollgruppe. Davon waren 6 PD-1/PD-L1-bezogener Zell-Ko-Kolokalisation involviert und 3 zeigten signifikante Interaktionen mit der Therapie. Wenn nach Rezeptor-Subtyp analysiert, zeigten 7 MH Indizes eine positive Korrelation mit der Pembrolizumab-Gruppe pCR und waren unassoziiert zur Kontrollgruppe. Diese Indizes waren alle PD-1/PD-L1-bezogener Zell-Ko-Kolokalisation verwandt und stark miteinander korreliert. Davon zeigten Ko-Kolokalisation von PD-1+ T-Zellen mit PD-L1+-Zellen oder PD-L1+-Tumorzellen und Ko-Kolokalisation von PD-1+ CD8+ zytotoxischen T-Zellen mit PD-L1+-Zellen eine Assoziation mit pCR sowohl bei Triple-Negative als auch bei HR+HER2--Tumoren.

Korrelation der räumlichen Nähe zwischen Immunzellen und Tumorzellen mit Pembrolizumab-Reaktion

Die Studie untersuchte weiter die räumliche Nähe zwischen Immunzellen und Tumorzellen mittels räumlicher Punktmuster-Analyse und nearest neighbor Verteilungsfunktionen. Die Ergebnisse deuteten an, dass bei pembrolizumab-behandelten Patienten eine engere räumliche Nähe zwischen bestimmten Immunzell-Populationen und Tumorzellen mit verbesserter Therapie-Reaktion assoziiert war. Spezifisch zeigte die räumliche Nähe zwischen PD-1+ T-Zellen und PD-L1+ Tumorzellen die stärkste Korrelation mit pCR, insbesondere bei Triple-Negative Brustkrebs. Zusätzlich fand die Studie heraus, dass auch die räumliche Nähe zwischen dendritischen Zellen und Tumorzellen mit der Pembrolizumab-Therapie-Reaktion assoziiert war, was eine potenzielle Rolle der Antigen-Präsentation für IZI-Wirksamkeit nahelegt. Diese Erkenntnisse unterstreichen die Bedeutung räumlicher Beziehungen innerhalb des Tumor-Immun-Mikromilieus bei der Bestimmung der Therapie-Reaktion auf Immuncheckpoint-Inhibitoren.

Referenzen    

Campbell MJ, Wolf DM, Yau C, Brown-Swigart L, Wulfkuhle J, Gallagher IR, Zhu Z, Bolen J, Vandenberg S, Hoyt C, Mori H, Borowsky A, Sit L, Perlmutter J, Asare SM; I-SPY2 Investigatoren; Nanda R, Liu MC, Yee D, DeMichele AM, Hylton NM, Pusztai L, Berry DA, Hirst GL, Petricoin EF, Veer LV, Esserman L. Multi-platform biomarkers of response to an immune checkpoint inhibitor in the neoadjuvant I-SPY 2 trial for early-stage breast cancer. Cell Rep Med. 2024 Nov 19;5(11):101799. doi: 10.1016/j.xcrm.2024.101799. Epub 2024 Nov 6. PMID: 39510069; PMCID: PMC11604542.  

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