Literaturvermittlung: Multiflorale Immunfluoreszenzfärbung der immunsystemischen Mikroumwelt von Kolorektalkrebstumoren

Literature Sharing: Multiplex-Immunfluoreszenzfärbung des Tumorimmunmikromilieus bei kolorektalem Karzinom

Hintergrund

Das Tumorimmunmikromilieu (TME) des kolorektalen Karzinoms enthält Schlüsselbiomarker für die antitumorale Immunantwort des Wirts und die Mechanismen der Immunflucht des Tumors. Die Dichte von T-Zell-Subpopulationen wie CD3⁺- und CD8⁺-T-Zellen hat sich als präziserer Prädiktor für das Rezidivrisiko erwiesen als die traditionelle histopathologische Stadieneinteilung. Darüber hinaus spielen gewebereisidente Gedächtnis-T-Zellen, die CD103 exprimieren, eine wichtige Rolle in der antitumoralen Immunität bei kolorektalem Karzinom und anderen Tumoren, wobei ihre Dichte mit den langfristigen onkologischen Ergebnissen korreliert. Daher ist die präzise Charakterisierung des Phänotyps, der Funktion und der räumlichen Verteilung der Immunzellen im TME entscheidend für die Entdeckung neuer Prognosemarker und die Leitung immuntherapeutischer Strategien. Die traditionelle chromogene Immunhistochemie (IHC) hat jedoch Einschränkungen wie begrenzte Markerdetektion, Schwierigkeiten bei der Kolokalisationsanalyse, Neigung zu Ergebnisabweichungen und zeitaufwändige Prozesse. Die Multiplex-Immunfluoreszenz (mIF) kann mehrere Marker gleichzeitig bewerten, ermöglicht die präzise Klassifizierung von Immunzellen und die räumliche Merkmalsanalyse mit Tumorgewebe und bietet somit ein ideales Werkzeug für die TME-Forschung. Die TSA-basierte mIF-Technologie erfordert keine Berücksichtigung der Spezies des Primärantikörpers oder der Immunglobulin-Unterklasse und weist eine hohe Signalempfindlichkeit und -helligkeit auf, die der traditionellen indirekten Immunfluoreszenz überlegen ist.

Daher hat die Studie von Cohen R et al. mit dem Titel „Optimising multiplex immunofluorescence staining for characterising the tumour immune micro-environment" den Prozess optimiert, um die Immunzellen im TME des kolorektalen Karzinoms mithilfe eines 5-farbigen TSA-mIF-Detektionssystems auf Basis einer automatisierten Färbungsplattform und eines konventionellen Fluoreszenzscanners präzise zu charakterisieren.

Experimentelles Design

Die Studie verwendete Gewebemikroarrays, die gesundes Kolonepithel, kolorektale Adenome verschiedener Grade und Adenokarzinome sowie kolorektale Karzinomgewebe als Proben enthielten. Die zentralen Detektionsmarker waren CD3, CD8, CD103 und Zytokeratin (CK), wobei DAPI als nukleärer Färbungsmarker diente. Zunächst wurden die Primärantikörperkonzentrationen durch chromogene IHC optimiert, gefolgt von einer Einzelfarb-Fluoreszenzfärbungsverifikation auf Basis der TSA-Technologie. Anschließend wurde das spektrale Übersprechen verschiedener Fluorophore in jedem Kanal des konventionellen Fluoreszenzmikroskop-Scanners bewertet und der Einfluss verschiedener Färbungsreihenfolgen der Detektionsmarker auf die Signalintensität untersucht. Schließlich wurde die optimale Färbungsreihenfolge bestimmt. Der Färbungsprozess basierte auf einer automatisierten Färbungsplattform, und es wurde eine Strategie der doppelten Fluorophor-Zuweisung angewendet, wobei Kontrollexperimente eingerichtet wurden. Die Software StrataQuest v.7.1 wurde für die Bildanalyse verwendet: Zunächst wurden Masken für epitheliale und stromale Regionen auf Basis der CK-Signale erzeugt, dann wurde die Kernsegmentierung mithilfe der DAPI-Signale durchgeführt, um einzelne Zellen zu identifizieren, gefolgt von der Überlagerung der CD3-, CD8- und CD103-Signale. Schließlich wurde die Dichte der Zielzellen in verschiedenen Regionen quantitativ analysiert, und die Wiederholbarkeit wurde durch Berechnung des Übereinstimmungskorrelationskoeffizienten verifiziert.

Optimierung der Primärantikörperkonzentration und Verifikation der Einzelfarb-Fluoreszenzfärbung

Vier Detektionsmarker, CD3, CD8, CD103 und CK, wurden mit DAB gefärbt, wobei die Primärantikörper bei verschiedenen Verdünnungsverhältnissen und Inkubationszeiten eingesetzt wurden. Basierend auf den optimierten Primärantikörperbedingungen aus der chromogenen IHC wurden CD3, CD8 und CD103 mit Opal 620 markiert und CK mit TSA-Cy5 für die Einzelfarb-Fluoreszenzfärbung. Die Ergebnisse waren mit der IHC-Färbung konsistent.

Bewertung des spektralen Übersprechens der Fluorophore in der Einzelfarb-Fluoreszenzfärbung

Das spektrale Übersprechen wurde für jede Primärantikörper-Fluorophor-Kombination in der Multiplexdetektion sorgfältig bewertet. Einzelfarbgefärbte Schnitte wurden in allen Kanälen gescannt, um das Vorhandensein von spektralem Übersprechen zu bestimmen. CD8-TSA Cy3 zeigte ein leichtes Übersprechen in den SpRed-Kanal, und CD103-Opal Polaris 780 zeigte ein leichtes Übersprechen in den Cy5-Kanal. Diese Ergebnisse lieferten die wesentliche Grundlage für die anschließende Fluorophor-Zuweisung und die Optimierung der Färbungsreihenfolge, und der Einfluss des Übersprechens auf die Zellklassifizierung konnte durch eine angemessene Marker-Fluorophor-Zuordnung und die Einstellung der Signalintensitätsschwelle vermieden werden.

Fluorophor-Zuweisung und Bestimmung der Färbungsreihenfolge

Hinsichtlich der Fluorophor-Zuweisung wurde CD103, um die Schwierigkeit der Elution von CD103-Antikörpern zu bewältigen und Auswirkungen auf Gewebe und Signale in nachfolgenden Schritten zu vermeiden, als letzte Färbung in der Multiplexdetektion festgelegt und mit dem Fluorophor Opal Polaris 780 gepaart. Drei Marker, CD8-Opal 620, CD3-Cy3 und CK-Cy5, wurden auf den Positionen 1, 2 und 3 der mIF-Färbungssequenz platziert, mit insgesamt 6 Permutationen. Durch den Vergleich der Signalintensität jedes Markers an verschiedenen Färbungspositionen wurde die optimale Reihenfolge identifiziert: CK-Cy5 blieb an allen drei Positionen am stabilsten, CD8-Opal 620 zeigte die stärkste Signalintensität, wenn es an dritter Stelle gefärbt wurde, und CD3-Cy3 zeigte das schwächste Signal, wenn es an erster Stelle gefärbt wurde. Schließlich wurde die Gesamtfärbungsreihenfolge als CK→CD3→CD8→CD103 bestimmt.

Ergebnisse der Multiplex-Immunfluoreszenz

Die traditionelle histopathologische Bewertung der Immunzellaktivität im Tumormikromilieu basiert auf ausgebildeten Anatomopathologen, die Merkmale beschreiben und monochromatische Gewebeschnitte semiquantitativ analysieren. Das Aufkommen leistungsfähiger digitaler Bildanalysesoftware hat die Vorteile der Multiplex-Färbungstechnologie voll ausgeschöpft und ermöglicht die maschinelle automatisierte Zellidentifizierung, Multi-Marker-Identifizierung, räumliche Hintergrundlokalisierung und anschließende quantitative Analyse. Diese Studie verwendete die Software StrataQuest v.7.1 von TissueGnostics (Österreich) für die quantitative Analyse von einfach-positiven, doppelt-positiven und dreifach-positiven Zellen. Zunächst wurden Masken für epitheliale und stromale Regionen mithilfe von Zytokeratinsignalen erzeugt, dann wurden einzelne Zellen durch Kernsegmentierungsalgorithmen auf Basis der DAPI-Signale identifiziert. Anschließend wurde die Klassifizierung von doppelt-positiven und dreifach-positiven Zellen auf Basis der Expression von CD3, CD8 und CD103 durch Marker-Signalüberlagerung in Kombination mit Backgating-Technologie bestätigt. Schließlich wurden regionale Zählungen und Flächenmessdaten der Zielzellen durch Computerquantifizierung erhalten.

Literaturverzeichnis

Cohen R, Lee-Pullen T, Miller TJ, Meehan K, Fuller K, McCoy MJ. Optimising multiplex immunofluorescence staining for characterising the tumour immune micro-environment. Methods. 2023 Nov;219:48-57. doi: 10.1016/j.ymeth.2023.09.004. Epub 2023 Sep 21. PMID: 37741563.    

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