Entwicklung rekombinanter Antikörper——Von Design bis Expression
Rekombinante Antikörper werden auch als genetisch modifizierte Antikörper bezeichnet. Es handelt sich dabei um Antikörper, die durch den folgenden Prozess gewonnen werden: Zunächst werden die entsprechenden Gensequenzen der Antikörper gemäß Bedarf mittels DNA-Rekombinationstechnologie modifiziert und neu kombiniert, anschließend in Plasmide konstruiert und schließlich über heterologe Proteinexpressionstechnologie in geeignete Wirtzellen transfiziert/transformiert.
Die Entwicklung rekombinanter Antikörper umfasst mehrere Teilbereiche, darunter Antikörperscreening, Sequenzoptimierung, genetische Modifikation von Antikörpern, Konstruktion von Expressionsvektoren und funktionelle Verifizierung. Durch einen systematischen Serviceprozess kann dies verschiedene Szenarien wie Grundlagenforschung, Entwicklung biologischer Produkte und präklinische Validierung unterstützen und die Effizienz sowie Qualität der Antikörpersammlung erheblich verbessern.
1. Antikörperscreening-Plattformen und -Strategien
Basierend auf Projektanforderungen und Probenquellen werden für das Antikörperscreening in der Regel folgende drei technische Plattformen eingesetzt:
Phagen-Display-Technologie: Geeignet für die Konstruktion groß angelegter scFv- oder Fab-Antikörperbibliotheken und wird weit verbreitet für die Affinitätsreifung von Zielantikörpern sowie für Epitop-Screening genutzt.
Hybridom-Technologie: Anwendbar für die Entwicklung von Immunantikörpern bei Tieren wie Mäusen mit einem ausgereiften Plattformansatz zur Screening und Subklonierung.
Singuläre B-Zell-Screening-Technologie: Durchflusszytometrische Sortierung und Einzelzell-Sequenzierung ermöglichen den direkten Gewinn von Antikörpern aus menschlichen oder tierischen Quellen mit natürlichen schweren Ketten-Leichten Ketten-Paarungen.
2. Design und Engineering-Optimierung von Antikörpersequenzen
Der Kern der Entwicklung rekombinanter Antikörper liegt im Engineering-Design von Antikörpersequenzen, das hauptsächlich folgende Aspekte umfasst:
Antikörperhumanisierung: Für Antikörper, die aus nicht-menschlichen Spezies wie Mäusen stammen, kann die Immunogenität reduziert werden, indem die CDR-Sequenzen beibehalten und die Rahmensequenzen ersetzt werden.
Affinitätssteigerung: Durch Strukturmodellierung oder gerichtete Mutagenese wird eine Mutantenbibliothek erstellt, gefolgt von einem zweiten Screening-Runde zur Gewinnung von Antikörpervarianten mit höherer Affinität.
Auswahl der strukturellen Konfiguration: Je nach Anwendungsanforderungen werden vollständige IgG-Antikörper, scFv, Fab, VHH-Einzeldomain-Antikörper oder weiter Konstrukte für bispesifische Antikörperstrukturen entworfen.
Zugleich sollte bei der Sequenzoptimierung auch auf verschiedene Parameter wie Aggregationsneigung, thermische Stabilität und die Erhaltung von Glykosylierungsstellen geachtet werden, um die Anforderungen für nachfolgende Expression und funktionelle Verifizierung zu erfüllen.
3. Konstruktion des Expressionsystems und Antikörperproduktion
Zu den gängigen mammalianen Expressionsystemen gehören das CHO-Zell-System und das HEK293-Zell-System.
CHO-Zell-Expressionsystem ist derzeit die am weitesten verbreitete Plattform für Antikörperexpression. Es eignet sich für langfristige stabile Expression, hohe Sekretionsleistung und industrielle Skalierung sowie für den Übergang zu GLP- oder GMP-Standards.
HEK293-Expressionsystem eignet sich für die Expression in kleinen Maßstäben, schnelles Screening oder transiente Transfektionsexperimente und ist für die Verifizierung der Antikörperexpression in frühen und mittleren Stadien anwendbar.
Bei der Konstruktion von Expressionsvektoren sollten Faktoren wie Promotoren (z.B. CMV, EF1α), Enhancer-Elemente (z.B. WPRE), Sequenzen für Signalpeptide und Termination ausgewählt werden, wobei eine Codonoptimierung durchgeführt wird. Die konstruierten Expressionsvektoren ermöglichen die Expression rekombinanter Antikörper durch Transfektion, Screening stabiler Klone oder transiente Expression.
4. Reinigung und funktionelle Verifizierung
Nach der Produktion rekombinanter Antikörper ist ein standardisierter Prozess der Reinigung und Qualitätsbewertung erforderlich.
Für die Antikörperreinigung wird Protein A/G-Affinitätschromatographie zur initialen Reinigung von Antikörpern verwendet. Bei Bedarf wird SEC ergänzt, um Aggregate zu entfernen. Zu den Qualitätsprüfungen gehören SDS-PAGE, SEC-HPLC, Endotoxin-Nachweis und Bestimmung der Antikörperkonzentration. Die funktionelle Verifizierung umfasst Tests wie ELISA, WB, IHC, SPR oder BLI zur Affinitätsdetektion. Für bestimmte Projekte sind zusätzlich Zellneutralisationsassays oder Fc-vermittelte Funktionsanalysen (z.B. ADCC) erforderlich.
FAQs
Q1:Was ist der Unterschied zwischen rekombinanten und traditionellen Antikörpern?
A1: Da rekombinante Antikörper aus einer spezifischen Gruppe von Genen hergestellt werden, ist deren Produktion kontrollierbar. Theoretisch können rekombinante Antikörper gegen jedes Antigen konstruiert werden. Gleichzeitig können Probleme wie Genlöschung, Genmutation und Zelllinien-Drift, die durch Hybridome verursacht werden, vermieden werden. Daher sind die Chargenschwankungen sehr gering, und die Ergebnisse sind hoch reproduzierbar. Durch den Einsatz rekombinanter Technologien kann die Spezifität und Sensitivität von Antikörpern durch Antikörperringenieing leichter verbessert werden. Während der Hybridom- und rekombinanten Klonierungsphasen können wir die gewünschten Klone auswählen, um die hochwertigsten Antikörper zu screenen.
Q2: Warum werden CHO-Zellen für die Expression der meisten rekombinanten Antikörper verwendet?
A2: Das CHO-Zell-Expressionsystem verfügt über exzellente Protein-Faltungsfähigkeiten und humanisierte Glykosylierungskapazitäten sowie hohe Expressionsniveaus, was es für die langfristige stabile Produktion geeignet macht. Darüber hinaus wurden seine Sicherheit und Machbarkeit durch eine Reihe bereits auf dem Markt zugelassener Antikörpermedikamente validiert.
Q3: Beeinflusst die Antikörperhumanisierung definitiv die Aktivität?
A3: Eine unangemessene Humanisierungsplanung kann die Bindungsfähigkeit beeinträchtigen, doch durch Strukturmodellierung und mehrere Runden der Affinitätsoptimierung kann die ursprüngliche Funktion beibehalten oder sogar verbessert werden, während gleichzeitig die Immunogenität reduziert wird.
Q4: Was sind die häufigsten Ursachen für das Scheitern der Antikörperexpression?
A4: Häufige Ursachen sind die fehlerhafte Konstruktion des Expressionsvektors, ein nicht übereinstimmendes Codon-Präferenzmuster, defekte Signalpeptidfunktionen, zytotoxisch exprimierte Proteine und abnormale Strukturregionen in der eigenen Sequenz des Antikörpers.
Q5: Was sind die Unterschiede zwischen der Expression und Reinigung rekombinanter Antikörper im Vergleich zu denen von rekombinanten Proteinen?
A5: Die zugrundeliegende Logik beider Prozesse ist identisch: Beide umfassen die Konstruktion eines Expressionsvektors durch Genklonierung, die heterologe Expression in Wirtzellen und anschließend das Isolieren und Reinigen des Zielproteins basierend auf seinen physikalischen, chemischen oder biologischen Eigenschaften. Allerdings gibt es signifikante Unterschiede bei den entscheidenden Schritten. Im Wesentlichen sind rekombinante Antikörper eine spezifische Unterklasse von rekombinanten Proteinen.
Hinsichtlich der Auswahl des Expression-Systems priorisieren rekombinante Antikörper eukaryotische Systeme wie CHO- und HEK293-Zellen, die eine Glykosylierungsmodifikation erfordern, um ihre Aktivität zu gewährleisten. Im Gegensatz dazu können gängige rekombinante Proteine flexibel in prokaryotischen, eukaryotischen oder anderen Systemen exprimiert werden, wobei keine zwingende Anforderung an die Glykosylierung besteht.
Bei der Reinigung unterziehen sich rekombinante Antikörper zunächst einer Protein A/G/L-Chromatographie, die die spezifische Bindung des konstanten Bereichs des Antikörpers nutzt, um die Reinheit schnell auf über 90 % zu erhöhen. Anschließend erfolgt eine Feinschritt-Reinigung durch Methoden wie Ionenaustauschchromatographie oder hydrophobe Interaktionschromatographie. Für gängige rekombinante Proteine werden Reinigungsmethoden – wie Affinitätschromatographie (z.B. His-Tag, GST-Tag), Ionenaustauschchromatographie und Gel-Filtrationschromatographie – je nach spezifischen Eigenschaften des Proteins ausgewählt.
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