Literaturvermittlung: Multiflokuläre Immunfluoreszenz in Kombination mit In-situ-Hybridisierung zur Analyse der Immunpathologie von Tiergeweben

Literature Sharing: Multiplex Immunofluorescence Combined with In situ Hybridization for Analysis of Animal Tissue Immunopathology

I. Hintergrund der Forschung

Das Gewebe als Schlüsselnetzwerk für Organe, Organsysteme und koordinierte biologische Funktionen von Organismen ist für das Verständnis und die Regulation der biologischen Ergebnisse entscheidend, die die tierische Gesundheit beeinflussen. Allerdings war die Forschung im Bereich der Veterinärmedizin in situ lange Zeit durch die Knappheit artspezifischer Immunreagenzien——die Verfügbarkeit von Immunreagenzien, die spezifische Zellen, Funktionen oder pathologische Marker adressieren, ist extrem gering, und selbst wenn relevante Reagenzien gefunden werden, können sie oft nur die gleichzeitige Detektion eines einzelnen oder weniger Marker erreichen, was eine umfassende biologische Interpretation des Gewebezustands schwierig macht.

Basierend auf diesem Kernengpass entwickelte die Forschung "In situ staining with antibodies cross-reactive in pigs, cattle, and white-tailed deer facilitates understanding of biological tissue status and immunopathology" ein multiplexes chromogenes Immunhistochemie-Schema für vergleichende Studien von Immunzellen in Lymphknoten verschiedener Spezies und bestätigte die Fähigkeit der fluoreszierenden Multiplex-Färbung, Proteinko-lokalisationssignale in Schweisgeweben nachzuweisen. Angesichts der Knappheit und des Herstellungschwierigkeiten proteinreaktiver Antikörper bei Tieren schlug die Forschung vor, Immunreagenzien durch RNA -Ebene-Design zu entwerfen und diese mit artspezifischer Antikörperfärbung in Multiplex-Kombinationen zu kombinieren, um die Grenzen der Immunreagenzien in der in-situ-Detektion zu überwinden. Um die Rolle der kombinierten RNA und Protein-Detektion bei der Aufklärung des Gewebezustands und der Immunpathologie zu bestätigen, erreichte die Forschung die gleichzeitige Färbung von zellspezifischen Proteinmarkern mit Seneca-Virus A (SVA) RNA in Schweismandelgewebe.

II. Forschungsmethoden

Gewebeproben wurden mit 10% neutralem Pufferfixativ für etwa 24 Stunden fixiert, gefolgt von routinemäßiger Dehydrierung, Paraffineinbettung und Schnittführung. Antikörper, die 5 wichtige Marker adressieren, wurden ausgewählt, einschließlich: Makrophagen/Dendritische Zellmarker IBA-1, T Zellenmarker CD3, B Zellenmarker Pax5, proliferierende Zellmarker Ki-67, Epithelzellmarker Zytokeratin. Anschließend wurde die Logik der Einzel-Färbung Immunhistochemie und Multiplex-Färbung Immunhistochemie-Verifizierung, Multiplex-Immunfluoreszenzfärbungsverifizierung, chromogenes Verfahren RNA in situ Hybridisierung, Multiplex-Immunfluoreszenz und RNA in situ Hybridisierung Ko-Detektion Verifizierung für Experimente befolgt. Nach Probenverarbeitung, Inkubation und Einbau wurden Fluoreszenzfärbungsergebnisse mit Nikon A1R Konfokalmikroskopie beobachtet. Multiplex-Immunfluoreszenz und RNA in situ Hybridisierung Ko-Detektion nutzte zuerst RNAscope Technologie für RNA in situ Hybridisierung, unter Verwendung von SVA Capsidprotein 1 Gensequenz als Zielsonden-Design; Protein und RNA Ko-Detektion basierte auf verbesserter RNAscope Multiplex Fluoreszenz Detektionskit integriert mit Immunfluoreszenz Ko-Detektionsworkflow, detektierte RNA Signale durch Opal 570, detektierte Proteinsignale durch TSA 650 kombiniert mit Sekundärantikörper. Antikörper-Kompatibilität mit RNAscope Technologie wurde zuerst verifiziert, dann unter Verwendung von Mandelgewebe aus SVA-infizierten Schweinen als Proben zur Erreichung der Ko-Detektion von SVA RNA und Zellmarkerproteinen.

III. Ergebnisanalyse

IHC-Detektion von Markern in tierischen Geweben

Der Kernzweck dieser Abbildung ist die Verifizierung der konservierten Reaktivität ausgewählter Antikörper in FFPE Geweben von drei verschiedenen veterinärmedizinischen Spezies: Schwein, Rind und Hirsch. Das Experiment verwendete Gaumenmandelgewebe als Detektionsproben, zeigend positive Färbungssignale von CD3, Pax5, IBA-1, gtIBA-1, Zytokeratin und Ki-67 in allen drei Spezies durch Einzelne IHC-Färbung. Alle ausgewählten Antikörper können spezifisch binden und Farbe entwickeln in Zielzellen aller drei Spezies.

Multiplex IHC und Fluoreszenz-Detektion von Markern

Abbildung A zeigt dreifache chromogene IHC-Ergebnisse, unter Verwendung von Tracheobronchial-Lymphknoten-Proben aus Schweinen, Rindern und Weißwedelhirschen zur gleichzeitigen Detektion von CD3, Pax5 und IBA-1. Ergebnisse zeigten, dass Lymphknoten-Immunstrukturen aller drei Spezies erwarteten histologischen Merkmalen entsprechen: parakortikale Bereiche dominiert von CD3+ T Zellen, subkapsuläre, trabekuläre und medulläre Sinus dominiert von IBA-1+ Makrophagen/DC, und lymphoide Follikel dominiert von Pax5+ B Zellen. Dieses Ergebnis beweist, dass dreifache chromogene IHC effektiv für vergleichende Analyse von Lymphknoten-Immunstrukturen über Spezies hinweg genutzt werden kann.

Abbildung B zeigt quadruple Immunfluoreszenzfärbungsergebnisse, unter Verwendung von Schweismesenterial-Lymphknoten-Proben zur gleichzeitigen Detektion von IBA-1, CD3, Pax5 und Ki-67, und zeigend Einzelkanal Graustufenbilder jedes Markers. Ergebnisse verifizierten nicht nur Immunzellverteilungsmuster konsistent mit Abbildung A, sondern erreichten auch klare Detektion von Ko-lokalisationssignalen, direkt identifizierend IBA-1+ Makrophagen/DC, Pax5+ B Zellen und CD3+ T Zellen gleichzeitig exprimierend Ki-67, deutend auf Vorhandensein von proliferierenden Immunzellen. Darüber hinaus ko-lokalisierten die meisten Ki-67+ Zellen mit Pax5+ Zellen und waren innerhalb lymphoider Follikel konzentriert, beweisend das Vorhandensein von aktiven Keimzentren enthaltend proliferierende B Zellen.

Kompatibilitätsverifizierung von Antikörperfärbung mit RNA In situ Hybridisierung

Unter Verwendung von Mandelgewebeproben aus Schweinen, Rindern und Weißwedelhirschen wurde die Kompatibilität ausgewählter Antikörper mit RNAscope RNA in situ Hybridisierung Technologie durch Fluoreszenzfärbung verifiziert. Das Experiment detektierte gleichzeitig jeden Proteinmarker mit Housekeeping Gen UBC's RNA, und zeigte Einzelkanal Graustufenbilder jedes Markers. In allen drei Spezies konnten Protein-Färbungssignale aller getesteten Antikörper klar mit UBC RNA Signalen ko-lokalisieren ohne offensichtliche Interferenz. Dies beweist, dass ausgewählte Antikörper kompatibel mit RNA in situ Hybridisierung Technologie sind, eine Schlüsselbasis bereitstellend für nachfolgende Entwicklung von Multiplex in-situ Schemata für "Protein-RNA Ko-Detektion".

Anwendung von Protein-RNA Ko-Detektion in Immunopathologie Forschung

Unter Verwendung von Mandelgewebe aus SVA-infizierten Schweinen als Proben wurde die Verteilung von SVA-spezifischem RNA im Gewebe zunächst durch chromogene Darstellung demonstriert, zeigend, dass virales RNA hauptsächlich in der subepithelialen Follikel-Interstitium-Parenchym und umgebenden Bereichen konzentriert war, klärend die Infektionslokalisierungszone des Virus im Gewebe. Dann multiplexe Fluoreszenzfärbung detektierte gleichzeitig Proteinmarker mit SVA RNA, und zeigte Einzelkanal Graustufenbilder von Schlüsselbereichen. Experimentelle Ergebnisse fanden, dass Seneca-Virus A 's RNA Signale und Zielprotein-Signale präzise lokalisierten in dieselben Zellen. Dies beweist nicht nur, dass das kombinierte Detektionsverfahren von "Antikörper-Detektion + RNA in situ Hybridisierung" zuverlässig und effektiv ist, sondern zeigt auch klar, dass dieses Virus tendiert zu infizieren welche Art von Zellen. Diese Methode bietet einen völlig neuen technischen Ansatz für die Untersuchung der immunpathologischen Mechanismen von Infektionskrankheiten im Veterinärbereich.

IV. Zusammenfassung

Diese Forschung adressiert die Kernschmerzpunkte von knappen artspezifischen Immunreagenzien und Schwierigkeiten in Multiplex-Marker-Detektion bei veterinärmedizinischer in-situ Forschung. Durch systematische Screening und Verifizierung etablierten wir erfolgreich eine Reihe von Multiplex in-situ Färbungstechniken, die in mehreren veterinärmedizinischen Spezies einschließlich Schweinen, Rindern und Hirschen verwendet werden können, einschließlich Hellfeld-Multiplex IHC, Fluoreszenz-Multiplex IHC und Protein-RNA integrierte in-situ Detektions-Schemata. Darüber hinaus haben ausgewählte Antikörper artspezifisch konservierte Reaktivität, können Zielzellmarker genau erkennen, Multiplex-Färbungsmethoden können klar Gewebeimmunlandschaften und zelluläre Funktionszustände zeigen, und Protein- und RNA Ko-Detektion kann effektiv Pathogeninfektionszielzelltypen identifizieren. Diese Forschungsergebnisse lösen nicht nur technische Schwierigkeiten bei traditioneller veterinärmedizinischer in-situ Forschung, sondern bieten standardisierte methodologische Werkzeuge für vergleichende Studien von Gewebemerkmale und Immunpathologie zwischen verschiedenen Tierarten. Gleichzeitig legen sie auch ein wichtiges technisches Fundament für nachfolgende Forschung zu Ursachen veterinärmedizinischer Infektionskrankheiten und Screening von Krankheitsdiagnosemarkern.

Referenzen

Wiarda JE, Zanella EL, Shircliff AL, Cassmann ED, Loving CL, Buckley AC, Palmer MV. In situ staining with antibodies cross-reactive in pigs, cattle, and white-tailed deer facilitates understanding of biological tissue status and immunopathology. Vet Immunol Immunopathol. 2025 Jan;279:110865. doi: 10.1016/j.vetimm.2024.110865. Epub 2024 Dec 12. PMID: 39719720.   

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