Literaturveröffentlichung: Anwendung der multiplexen Immunfluoreszenz bei der Untersuchung der tertiären lymphozytenreichen Strukturen von Tumoren

Literatur-Sharing: Anwendung von Multiplex-Immunfluoreszenz bei der Untersuchung von Tumor-tertiären lymphoiden Strukturen

Hintergrund

Tertiäre lymphoide Strukturen (TLSs) sind exotische lymphoide Aggregate, die sich innerhalb oder benachbart zu Tumoren entwickeln können und eine antitumorale Immunaktivierung auslösen. Ihr Reifegrad steht in enger Beziehung zur immuntherapeutischen Wirksamkeit der Patienten und zum Überleben, wodurch sie vielversprechende prognostische Marker darstellen. Die TLS-Forschung wurde jedoch lange durch technische Engpässe begrenzt: Erstens können traditionelle Einzelmarker-Immunhistochemien funktionale TLSs von gewöhnlichen Immunaggregaten nicht unterscheiden, was zu hohen Fehlerraten führt. Zweitens erschwert das Fehlen gleichzeitiger mehrdimensionaler Marker-Evaluation die Festlegung von Reifegrad-Standards. Drittens behindert die Inkompatibilität zwischen präklinischen Mausmodellen und Patientengewebe-Detektionsmethoden die translative Forschung.

Opal-TSA-Multiplex-Immunfluoreszenz (mIF) Technologie, mit ihrer hohen Empfindlichkeit und Färbeflexibilität, wurde zu einer idealen Wahl, um diese Engpässe zu überwinden. Die Literatur "Protokoll zur Untersuchung von tertiären lymphoiden Strukturen in menschlichen und murinen festgewebten Schnitten unter Verwendung von Opal-TSA-Multiplex-Immunhistochemie" konzentriert sich auf Opal-TSA-Multiplex-Immunfluoreszenz-Technologie und erstellt ein standardisiertes Forschungsprotokoll für TLSs in menschlichen und Maus-Tumor-Gewebe. Als wichtige exotische lymphoide Aggregate im Tumormikroumfeld ist die präzise Identifizierung und funktionelle Charakterisierung von TLSs für die Tumorimmunforschung entscheidend. Durch den innovativen Einsatz der mIF-Technologie bietet diese Literatur einen zuverlässigen Weg, um technische Engpässe in der TLS-Forschung zu lösen.

Experimentelles Design

Um den Reifegrad von TLSs zu bestimmen, wählten die Autoren Antikörper CD4, CD8, CD19, CD21, DC-LAMP, PNAd und DAPI zur Sieben-Färbung von TLSs in menschlichen Formalin-fixierten Paraffin-eingebetteten (FFPE) Gewebeschnitten. In Maus-Gewebe-Schnitten wurde der DC-LAMP-Antikörper entfernt für eine Sechs-Färbung von TLSs. Dies deckt die Kernzellzusammensetzung der TLSs ab und unterscheidet TLSs von gewöhnlichen Immunzellaggregaten durch Marker-Kokkolation. Die Zuordnung der Fluoreszenzfarbstoffe folgt dem Prinzip des Paarings von niedrigen Antigien mit hellen Fluoreszenzfarbstoffen: Niedrige-Expression-Marker werden mit helleren Fluoreszenzfarbstoffen wie Opal™620 oder Opal™520 gepaart, während hohe-Expression-Marker mit weniger hellen Fluoreszenzfarbstoffen wie Opal™690 gepaart werden. Die Färbereihenfolge wurde dann durch Hitze-Stress-Tests bestimmt. Unter festgelegter Expositionzeit wurden die Unterschiede der Färbungsintensität der Schnitte beobachtet: Marker, die empfindlich gegenüber HIER sind, wurden zuerst detektiert, während widerstandsfähige Marker später detektiert wurden. Ein 50°C niedriger-pH Glycin-Puffer wurde für die Antikörper-Elimination verwendet, um eine vollständige Entfernung der vorherigen Runde von Antikörpern zu gewährleisten, ohne die bereits gebundenen fluoreszenten Signale zu beeinträchtigen. Nach der Färbung wurden Panorama-Scanning und multispektrale Bildgebung durchgeführt unter Verwendung des Vectra automatisierten quantitativen Pathologie-Bildgebungssystems, kombiniert mit Phenochart, inForm und HALO-Software für Bildspektral-Demischung, Zellphänotyp-Analyse und quantitative Statistik.

Mehrmarker-Kokkolation

Durch Sieben-Marker Opal-TSA-Technologie wurde Multiplex-Färbung an repräsentativen menschlichen lymphknoten FFPE Gewebeschnitten durchgeführt. Sowohl manuelle als auch automatisierte Färbung identifizierten und charakterisierten erfolgreich Immunzellaggregat und TLSs auf FFPE Gewebeschnitten.

Konstruktion eines Reifegrad-Systems für menschliche TumorgewebeTLSs

Um ein TLSs Reifegrad-System zu konstruieren, entwarf der Artikel ein Vergleichsschema von TLSs-Grading in verschiedenen Regionen desselben Gewebes. Vier typische Regionen wurden aus menschlichen Prostata-Krebs-FFPE Gewebeschnitten ausgewählt: Immunzell-Infiltration (Grade 0), Immunzell-Aggregation (Grade 1), unreife TLS (Grade 2) und reife TLS (Grade 3). Intuitive Quantifizierung von Grading-Standards wurde durch einheitliche Marker-Färbung und Bildgebung-Parameter erreicht.

Durch das vorgeschlagene TLSs Reifegrad-System wurden Grade 2 und Grade 3 TLSs erfolgreich in Melanom FFPE Gewebeschnitten durch manuelle Färbung identifiziert. Zusätzlich wurde eine automatische Färbung erfolgreich in menschlichen Prostata-Krebs FFPE Gewebeschnitten implementiert. Dies zeigt, dass das konstruierte TLSs Reifegrad-System Immunzellaggregate, unreife TLSs und reife TLSs in menschlichen FFPE Tumorgewebe-Schnitten identifizieren und gradieren kann.

Kreuz-Spezies-Bild-Validierung von TLSs Reifegrad-System

Um die kreuz-spezifische Anpassungsfähigkeit des Protokolls zu überprüfen, präsentiert der Artikel gleichzeitig mIF-Bilder von Maus-Magenkrebs Gewebeschnitten unter Verwendung von sechs-Farben gelabelten Opal-TSA. Die Bildergebnisse zeigen eine genaue Identifizierung und Klassifizierung von TLSs Reifegrad in Maus-Gewebe-Schnitten, einschließlich Immunzell-Infiltration, Immunzell-Aggregation, unreifer TLS und reifer TLS. Ähnlich können auch Grade 2 und Grade 3 TLS erfolgreich in Maus-Magenkrebs Gewebeschnitten durch manuelle Färbung identifiziert werden.

Der Wert von kreuz-spezifischen Bildern liegt nicht nur in der Verifizierung technischer Universalität sondern auch im Aufbau einer Brücke für korrelierte Studien zwischen "präklinischen Mausmodellen - klinische Patientengewebe". Dies ermöglicht eine vorläufige Vorhersage ihrer Anwendungsprospekte in Menschen durch Bildmerkmal-Analogie, beschleunigt den Prozess der translationalen Grundlagenforschung zu klinischer Praxis.

Zusammenfassung

Durch den innovativen Einsatz von Multiplex-Immunfluoreszenz-Bildern upgraded die Autoren mIF-Technologie von einer einfachen Färbungsmethode zu einem bildgestützten Forschungswerkzeug. Sie konstruierten ein experimentelles Protokoll basierend auf Opal-TSA-Multiplex-Immunhistochemie-Technologie, das eine in-situ Detektion und Charakterisierung von TLSs in menschlichen und Maus-Gewebe-Schnitten ermöglicht. Dieses Protokoll unterstützt die gleichzeitige Detektion bis zu 6 Antigen-Marker und bietet ein unterstützendes Grading-System zur Unterscheidung unreifer und reifer TLSs, offeriert einen vollständigen technischen Workflow von Detektion zu Ergebnisinterpretation für TLSs bei der Analyse des Tumor-Immun-Mikroumfelds und Bewertung der Immuntherapie-Wirksamkeit.

Referenzen

Quigley LT, Pang L, Tavancheh E, Ernst M, Behren A, Huynh J, Da Gama Duarte J. Protokoll zur Untersuchung von tertiären lymphoiden Strukturen in menschlichen und murinen festgewebten Schnitten unter Verwendung von Opal™-TSA Multiplex-Immunhistochemie. STAR Protoc. 2023 Mar 17;4(1):101961. doi: 10.1016/j.xpro.2022.101961. Epub 2023 Jan 10. PMID: 36633948; PMCID: PMC9843255.

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