Häufige Methoden zur Antikörperreinigung
Unter Antikörperreinigung versteht man das Isolieren von polyklonalen Antikörpern aus Serum oder monoklonaler Antikörpern aus Ascitesflüssigkeit oder dem Kulturüberstand von Hybridomzelllinien. Das Kernziel besteht darin, Antikörper mit hoher Reinheit und hoher Aktivität zu gewinnen, die den Anforderungen spezifischer Anwendungen entsprechen.
Die Antikörperreinigung ist ein Prozess, der sich auf die biologischen Eigenschaften von Antikörpern stützt – wie Ladung, Größe und Hydrophobie der Antikörpermoleküle –, um geeignete Methoden zu wählen und Zielantikörper aus komplexen Mischungen durch mehrstufige chromatographische Techniken zu isolieren.
Im Allgemeinen umfassen Antikörperreinigungsverfahren Protein A/G-Affinitätschromatographie, Ionenaustauschchromatographie, Gel-Filtrationschromatographie, hydrophobe Wechselwirkungschromatographie und andere, die eine sichere Gewinnung von hochreinen Antikörperprodukten gewährleisten. Ein einzelner, schneller Erfassungsschritt mittels Affinitätschromatographie ist ausreichend, um die erforderliche Reinheit und Menge des Zielprodukts zu erreichen. Allerdings können Antikörper oder ihre Fragmente durch weitere Methoden zur Entfernung von zusätzlichen Verunreinigungen weiter gereinigt werden, um für den späteren Gebrauch aufbereitet zu werden.
Die Auswahl einer spezifischen Reinigungsmethode hängt von Faktoren wie der Quelle des Antikörpers, Zeitbeschränkungen, Kostengründen und der finalen Anwendung des Antikörpers ab.
Methode der Caprylsäure-Ammoniumsulfat-Fällung
Das Verfahren der Caprylsäure-Ammoniumsulfat-Fällung nutzt die Eigenschaften von Caprylsäure und Ammoniumsulfat, um Antikörper selektiv zu fällen und zu reinigen. Es wird hauptsächlich verwendet, um IgG-Antikörper aus Serum oder Ascitesflüssigkeit extrahieren.
Unter leicht sauren Bedingungen bindet Caprylsäure andere Proteine im Serum oder in der Ascitesflüssigkeit und fällt sie aus, während IgG-Antikörper in der Supernate verbleiben. Dies liegt daran, dass Caprylsäure die Hydrathüllen anderer Proteine stört, was zu deren Fällung führt, wohingegen IgG-Antikörper – aufgrund ihrer strukturellen Eigenschaften – weniger anfällig für Fällung sind.
Nach der Behandlung mit Caprylsäure wird die Ammoniumsulfat-Fällung zur Ausfällung verwendet. Ammoniumsulfat konkurriert mit Antikörpern um Wassermoleküle in der Lösung, verringert die Löslichkeit der Antikörper und führt damit zu deren Fällung. Ein gleiches Volumen einer gesättigten Ammoniumsulfatlösung wird langsam zum neutralisierten Antikörproben zugesetzt, gefolgt von einer Inkubation bei Raumtemperatur oder 4°C für mehrere Stunden. Nach Zentrifugierung und Entfernung der Supernate wird das Antikörperniederschlag in eine Pufferlösung gelöst.
Die Selektivität, der Ausbeute, die Reinheit und Reproduzierbarkeit der Fällung hängen von mehreren Faktoren ab, einschließlich Zeit, Temperatur, pH-Wert und Geschwindigkeit des Salzaddition. Die Ammoniumsulfat-Fällung kann für bestimmte Antikörperanwendungen eine ausreichende Reinigungseffizienz bieten; jedoch dient sie in den meisten Fällen als vorläufiger Reinigungsschritt vor der Säulenchromatographie oder anderen Reinigungsmethoden.
Affinitätschromatographie-Methode
Antikörperreinigung mit Affinitätschromatographie[1]
Die Affinitätschromatographie ist eine hocheffiziente Trenn- und Reinigungstechnologie, die auf der spezifischen Erkennung von Biomolekülen basiert. Dieses Verfahren bildet ein Separationssystem mit selektiver Adsorptionskapazität, indem man spezifische Liganden (wie Protein A/G/L) an feste Phasen-Matrizen wie Agarose koppelt. Wenn eine komplexe Mischung hinzugefügt wird, kann der Ligand den Zielantikörper spezifisch erfassen, während Verunreinigungen eluiert werden und der Zielantikörper schließlich gewonnen wird. Diese Technologie eignet sich besonders zum Isolieren von Antikörpern aus Mischungen mit komplexen Komponenten, bei denen der Gehalt an Verunreinigungen viel höher ist als der des Zielantikörpers.
Protein A kann IgG aus verschiedenen Säugetieren effizient binden, einschließlich Menschen, Mäusen, Kaninchen, Schweinen und Hunden. Davon zeigt es eine extrem hohe Affinität zu den humanen IgG1-, IgG2- und IgG4-Subtypen, aber hat eine schwache Bindung zu IgG3.
Im Vergleich zu Protein A weist Protein G eine höhere Bindungsaffinität für IgG aus den meisten Säugetieren auf und kann eine breitere Palette von Antikörpertypen spezifisch binden – insbesondere solche, die für Protein A schwierig zu binden sind, wie humanes IgG3, murines IgG1 und ratiales IgG2a. Rekombinantes Protein G hat seine Albumin-Bindungsstellen und Zelloberflächen-Bindungsstellen entfernt, was nicht nur die nichtspezifische Bindung signifikant reduziert, sondern auch die Reinheit des Produkts verbessert. Dieses Protein ist zu einem wichtigen Werkzeug für die Antikörperreinigung geworden und eignet sich besonders zur Reinigung von murinen monoklonalen und polyklonalen IgG-Antikörpern, die gut an Protein A binden.
Protein L kann spezifisch κ (Kappa) Leuchtketten durch seine fünf N-terminalen homologen Domänen binden. Dieses Bindungsmodell ermöglicht es ihm, verschiedene Antikörpermoleküle zu erfassen, die κ-Leuchtketten enthalten. Das Protein kann effektiv an mehrere Antikörpertypen wie IgG, IgM, IgA, IgE und IgD binden und kann auch Antikörperderivate wie Single-Chain Variable Fragments (ScFv) und Fragment antigen-binding (Fab)-Fragmente erkennen. Protein L weist eine gute Bindungsfähigkeit an aus Menschen, Mäusen, Ratten und Kaninchen stammende Antikörper auf, hat aber keine Bindungsaktivität gegenüber Immunglobulinen von Ziegen und Schafen. Protein L bietet eine wichtige Lösung für die Reinigung von Antikörpern mit speziellen Strukturen.
Übersicht der Bioaffinitätsliganden Protein-A, -G, -L und -M[2]
| Protein Type | Binds to | Advantages | Disadvantages |
|---|---|---|---|
| Protein-A | •IgG, IgG Fragments und Subklassen (außer IgG₃), Hinge-Region, die Cₕ₂ und Cₕ₃ im Fc-Bereich von IgG verbindet (hohe Affinität ~ 10 nM) •Fc-Fusionsproteine •IgM und IgE | •Hohe Durchflussrate •Hohe Bindungskapazität •Bindet Fc und Fab- sowie F(ab’)₂-Fragmente von IgG | •Einige nichtspezifische Bindung von Wirtzellproteinen |
| Protein-G | •IgG₁, IgG₂, IgG₃ und IgG₄ •Hinge-Region, die Cₕ₂ und Cₕ₃ im Fc-Bereich von IgG verbindet (hohe Affinität ~10 nM) •Konstante Domäne der Fab durch Cₕ₁ (niedrige Affinität μΜ) •Humanes IgE, IgD und IgA | •Breiterer Reaktivitätsprofil zu IgG als Protein-A | •Hält nicht so harte Elutionsbedingungen aus wie Protein-A |
| Protein-L | •Vₗ von κ (Kappa) Leuchtketten (Kₚ ~ 100 mM), bindet an IgG, IgM, IgA, IgE und IgD (enthaltend variable Leuchtketten) | •Sehr effektiv bei der Bindung von Antikörpern in Ascitesflüssigkeit oder Zellkulturüberstand •Sehr effektive Bindung von IgM | •Nicht nützlich zur Reinigung von polyklonalen Antikörpern |
| Protein-M | •Protein M bindet an konservierte Regionen (Framework-Regionen) der Vₗ und Vₖ Antikörper Leuchtketten | •Breite Antikörperspezifität | •Noch nicht vollständig untersucht |
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Referenzen
[1] Cassedy, A., O’Kennedy, R. (2022). Antibody Purification Using Affinity Chromatography. In: Ayyar, B.V., Arora, S. (eds) Affinity Chromatography. Methods in Molecular Biology, vol 2466. Humana, New York, NY. https://doi.org/10.1007/978-1-0716-2176-9_1.
[2] Murphy, C., Devine, T., & O’Kennedy, R. (2016). Technology advancements in antibody purification. Antibody Technology Journal, 6, 17–32. https://doi.org/10.2147/ANTI.S64762.
 | Felicia Felicia ist eine technische Support-Spezialistin bei EnkiLife mit umfangreicher professioneller Erfahrung in der Antikörperentwicklung, Optimierung und ELISA-Assay-Design und -Anwendung. Sie ist bestrebt, unsere Kunden dabei zu unterstützen, geeignete Antikörperprodukte auszuwählen, ELISA-experimentelle Protokolle zu optimieren und technische Herausforderungen im Prozess aufzulösen, wodurch sie den reibungslosen Fortschritt ihrer Life-Science-Forschungsprojekte unterstützt. |