Prinzipien und Methoden der Screening von Hybridom-Zellen
Bei der Herstellung monoklonaler Antikörper gibt es zwei Screening-Prozesse. Das erste ist das Screening auf Hybridom-Zellen, und das zweite ist ein weiteres Screening zur Identifizierung von Hybridom-Zellen, die spezifische Antikörper produzieren.
Erstes Screening
Während der Fusion von B-Zellen und Tumorzellen existieren verschiedene Zelltypen, einschließlich unfusierter B-Zellen, unfusierter Tumorzellen, „B-Zelle-B-Zelle"-fusierte Zellen, „Tumorzelle-Tumorzelle"-fusierte Zellen und „B-Zelle-Tumorzelle"-fusierte Zellen. Unser Ziel ist es, die Hybridom-Zellen zu isolieren, die durch die Fusion von B-Zellen und Tumorzellen entstehen. Die selektive Kultivierung von Hybridom-Zellen ist der Schlüssel zum ersten Screening-Rundgang, und HAT-Selektivmedium wird hierfür üblicherweise verwendet.
In HAT-Medium steht H für Hypoxanthin, A für Aminopterin und T für Thymin. Das Ziel der Zugabe von Aminopterin in HAT-Medium ist die Hemmung des Hauptwegs der Nukleotidsynthese. Die Zugabe von Hypoxanthin und Thymin zielt darauf ab, Rohstoffe für den alternativen Weg der Nukleotidsynthese bereitzustellen, wodurch Zellen DNA durch den Rettenweg (Salvage Pathway) synthetisieren können.
Die zelluläre DNA-Synthese umfasst zwei Wege: de-novo-Synthese und Retten-Synthese. De-novo-Synthese bezieht sich auf den Weg, bei dem Nukleotide aus Aminosäuren und anderen kleinen Molekülverbindungen synthetisiert werden, gefolgt von der weiteren Synthese von DNA aus diesen Nukleotiden. In diesem Prozess fungiert Dihydrofolatreduktase als wichtiges Coenzym.
Der Rettenweg ist ein Prozess, bei dem Hypoxanthin und Thymin durch Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase (HGPRT) und Thymidin-Kinase (TK) in entsprechende Nukleotide umgewandelt werden, gefolgt von der weiteren DNA-Synthese. Sowohl HGPRT als auch TK sind für diesen Weg unverzichtbar.
Tumorzellen缺乏 HGPRT, ein Schlüsselenzym des Rettenwegs, und können daher Hypoxanthin zur DNA-Synthese über diesen Weg nicht nutzen. In HAT-Medium überleben sie nicht, da Aminopterin den de-novo-Syntheseweg hemmt.
B-Zellen können DNA unter Verwendung von Hypoxanthin und Thymin über den Rettenweg synthetisieren, was ihnen das Überleben in HAT-Medium ermöglicht. Allerdings sind B-Zellen nicht in der Lage, sich unbegrenzt zu vermehren, sodass sie schnell sterben, auch wenn sie zunächst überleben.
Erfolgreich fusionierte Hybridom-Zellen erben sowohl die unbegrenzte Vermehrungsfähigkeit von Tumorzellen als auch das Rettenweg-Enzym HGPRT aus B-Zellen. Daher können sie Nukleotide im HAT-Medium über den Rettenweg synthetisieren und kontinuierliches Überleben sowie Vermehrung aufrechterhalten.
Zweites Screening
Während der Produktion monoklonaler Antikörper variieren die durch Hybridom-Zellen produzierten Antikörper aufgrund der spezifischen Spezifität der B-Zellen erheblich. Diese umfassen spezifische antikörperproduzierende Zellen, irrelevante antikörperproduzierende Zellen und nicht-antikörperproduzierende Zellen. Daher ist ein zweites Screening von Hybridom-Zellen erforderlich, um diejenigen auszuwählen, die das Zielantikörper produzieren können, gefolgt vom Klonen – was bedeutet, Zellen zu kultivieren und zu vermehren, die aus einer einzelnen Zelle in einem Kulturwell entstehen, um die Homogenität der sezernierten Antikörper sicherzustellen.
Die am häufigsten verwendete Methode zum Screening von Hybridom-Zellen, die spezifische monoklonale Antikörper sezernieren, ist der Limitierte Verdünnungs-Assay. Folgend dem Prinzip der seriellen Gradientenverdünnung wird die Zell Suspension seriell verdünnt auf eine extrem niedrige Dichte und in 96-Well-Platten inkubiert, bis einzelne Zellschläge in den Wells erscheinen. Diese Methode ist einfach und leicht zu bedienen, aber relativ zeitaufwändig im gesamten Kultivierungsprozess. Die spezifischen Schritte sind wie folgt:
Positive Hybridom-Zell-Wells mit der ELISA-Methode identifizieren, eine Zell Suspension mit Vollmedium vorbereiten und die Zellen zählen.
Die Zell Suspension in ein geeichtes Zentrifugierglas überführen und seriell auf eine Konzentration von 5–10 Zellen/mL verdünnen.
Die verdünnte Zell Suspension separat in 96-Well-Platten inkubieren und im Inkubator kultivieren.
Nach der Zelladhäsion die Anzahl der Zellen in jedem Well unter einem Invertiermikroskop beobachten, Wells markieren, die nur eine einzelne Zelle enthalten, und weiter kultivieren. Während der Inkubation entscheiden Sie, ob das Medium basierend auf Änderungen des pH-Werts des Mediums ersetzt werden soll.
Wenn die Zellen in den positiven Wells nicht garantiert werden können, aus einer einzelnen Zelle zu stammen, wiederholen Sie das limitierte Verdünnungsverfahren und die oben genannten Schritte, bis bestätigt wird, dass sich proliferierende Zellen in den Wells monoklonal sind.
Hinweis
Hybridom-Zellen, die positiv auf Antikörpersekretion getestet wurden, sollten so früh wie möglich geklont werden. Andernfalls können antikörperproduzierende Zellen von nicht-antikörperproduzierenden Zellen unterdrückt werden – da nicht-antikörperproduzierende Zellen schneller wachsen, wird der Wettbewerb zwischen den beiden Zelltypen schließlich zum Verlust der antikörperproduzierenden Zellen führen.
Selbst geklonte Hybridom-Zellen erfordern regelmäßige Re-Klonierung, um Mutationen oder Chromosomenverlust in den Zellen zu verhindern, was zum Verlust ihrer Antikörper-produzierenden Fähigkeit führen könnte.
 | Felicia Felicia ist eine technische Unterstützungsspezialistin bei EnkiLife mit umfangreicher professioneller Erfahrung in der Antikörperentwicklung, Optimierung sowie ELISA-Assay-Design und Anwendung. Sie widmet sich der Unterstützung unserer Kunden dabei, geeignete Antikörperprodukte auszuwählen, ELISA-experimentelle Protokolle zu optimieren und technische Herausforderungen im Prozess aufzulösen, wodurch sie den reibungslosen Fortschritt ihrer life-science-Forschungsprojekte unterstützen. |