Kurze Einleitung zum CY-Cyaninfluoreszenzfarbstoff für Beschriftung

CY steht für Cyanin, was eine Molekülgruppe mit mehreren Methyl-Brückenketten zwischen zwei Stickstoffatomen und dispergierten Ladungen bezeichnet. Obwohl das Wort „Cyanin" etymologisch vom blauen Farbton abgeleitet ist, umfasst die Cyanin-Familie eine Vielzahl von Farbstofftypen im elektromagnetischen Spektrum, die sich von nahem Infrarot bis zum Ultravioletten erstrecken. Klassische Cyanine enthalten zwei stickstoffhaltige Heterozyklen mit konjugierten Ketten aus Kohlenstoff-Wasserstoff (CH), wobei n ungerade oder gerade sein kann. Aufgrund ihrer Struktur weisen diese Farbstoffe extrem hohe Extinktionskoeffizienten auf, die typischerweise über 100.000 L/(mol * cm) liegen. Verschiedene Substituenten innerhalb des Moleküls können die Eigenschaften wie Absorptionswellenlänge, Photostabilität und Fluoreszenz steuern. Zum Beispiel können die Absorptions- und Emissionswellenlängen durch Auswahl der Länge der polymerisierten Vinyliden-Einheit gesteuert werden: längere Cyanine haben höhere Absorptions- und Emissionswellenlängen bis in den Bereich des nahen Infraroten (wie in Abbildung 1 gezeigt). Basierend auf der Anzahl der Kohlenstoffatome in der Kette werden Cyanine in drei Gruppen unterteilt: ein Methyl (CY1, n=0), drei Methyl (CY3, n=1), fünf Methyl (CY5, n=2) und sieben Methyl (CY7, n=3). Neben der Zellbildgebung werden sie auch häufig im biologischen Screening, Protein-Immunblotting, biomedizinischer Bildgebung und Kleintier-In-Vivo-Bildgebung verwendet.

	Name	Chromophor	Kohlenstoffatome zwischen Chromophoren	Name	Chromophor
n=0	CY1
n=1	CY3		3	CY3.5
n=2	CY5		5	CY5.5
n=3	CY7		7	CY7.5

Abbildung 1 Beispiele für Strukturoformeln verschiedener Cyanin-Farbstoffe 

Eine weitere Klassifizierungsmethode basiert auf der Anzahl der Kohlenstoffatome zwischen zwei Indolinen-Gruppen, wobei Cy für „Cyanin-Farbstoff" steht: CY3 repräsentiert drei Kohlenstoffatome zwischen zwei Indolin-Gruppen, CY5 fünf Kohlenstoffatome zwischen zwei Indolin-Gruppen usw. (wie in Abbildung 2 gezeigt). Das CY2-Farbstoff ist jedoch eine Ausnahme (wie in Abbildung 3 dargestellt), da es sich um ein Derivat aus Sauerstoff statt Indolin handelt; dieses Sauerstoffderivat enthält jedoch drei Kohlenstoffatome, was von CY3 unterschieden werden muss.

Abbildung 2 CY3, CY5, CY7 Strukturoformeln

Abbildung 3 Vergleich der Strukturoformeln von CY2 und CY3

Bei Farbstoffen wie Cy3.5, Cy5.5 und Cy7.5 unterscheidet sich die Indolin-Gruppe von CY3, CY5 und CY7 dadurch, dass sie durch eine Struktur ersetzt wird, die ein Benzo[a]-Grupp enthält (wie in Abbildung 4 gezeigt). Strukturanpassungen können die Fluoreszenz-Eigenschaften der Moleküle verändern, wodurch mehrere Fluoreszenz-Gruppen den Großteil des sichtbaren und nahinfraroten Spektralbereichs abdecken können (wie in Abbildung 5 dargestellt).

Abbildung 4  Vergleich der Strukturoformeln von CY3/CY3.5, CY5/CY5.5, CY7/CY7.5

Abbildung 5 Spektrenanalyse gängiger Cyanin-Farbstoffe

Cyanine-Farbstoffe wurden vor über einem Jahrhundert erstmals synthetisiert. Ursprünglich wurden sie verwendet, um den Empfindlichkeitsbereich fotografischer Emulsionen zu erweitern – insbesondere, um den Wellenlängenbereich zu erweitern, der zur Bildbildung fähig ist –, wodurch die Farbvielfalt filmbasierter Bilder verbessert wurde. Folglich wurden sie auch in CD-R- und DVD-R-Medien eingesetzt. Die hauptsächlich verwendeten Typen waren grüne oder blassblaue Farbstoffe, aber diese zeigten chemische Instabilität. Moderne Cyanine enthalten Stabilisatoren, typischerweise Metallatome, die an den Cyanin-Farbstoffmoleküle gebunden sind, was den Abbau deutlich verlangsamt und die Farbstoff-Stabilität verbessert. Die Archivlebensdauer optischer Datenträger mit diesen Farbstoffen beträgt im Allgemeinen 75 Jahre oder länger. In den frühen 1990er Jahren führten Alan Waggoner und seine Kollegen an der Carnegie Mellon University (CMU) Magenta-Farbstoffe ein, die später in den Lebenswissenschaften extrem beliebt wurden. Diese Farbstoffe waren Modifikationen von Indocyanin-Grün (ICG), einem Magenta-Farbstoff, der seit den 1970er Jahren bei der Angiographie verwendet wurde, und alle enthalten zwei Indolen-Ringe, die eine Polymethylen-Kette flankieren. Diese Farbstoffe wurden als geringe unspezifische Bindung an Biomoleküle gefunden und zeigen helle Fluoreszenz aufgrund ihrer hohen molaren Extinktionskoeffizienten und günstigen Quantenausbeuten. Die Bezeichnungen Cy3 und Cy5 wurden erstmals von Ernst et al. im Jahr 1989 vorgeschlagen. Diese Bezeichnungen sind nicht standardisiert, da sie keine Andeutung der chemischen Strukturen der Farbstoffe liefern. In der ursprünglichen Arbeit repräsentierten die numerischen Suffixe die Anzahl der Methylen-Gruppen (wie in Abbildung 1 gezeigt), während die Seitenketten unangegeben blieben. Diese Mehrdeutigkeit hat dazu geführt, dass in der Literatur verschiedene Strukturen als Cy3 oder Cy5 bezeichnet werden. Die R-Gruppen (in ihrer Struktur) müssen nicht identisch sein; bei den tatsächlich verwendeten Farbstoffen sind dies kurze aliphatische Ketten mit hochreaktiven Gruppen – wie N-Hydroxysuccinimid oder Methylen-Carbonsäure –, die an einem oder beiden Enden angebracht sind. Obwohl der Patentschutz für standardisierte Cy-Reihe-Farbstoffe ausgelaufen ist, bleibt das Warenzeichen für die „Cy"-Bezeichnung bestehen. Als Ergebnis existieren nun Farbstoffe, die strukturell identisch mit CY-Farbstoffen sind, aber unter anderen Namen verkauft werden, ebenso wie Farbstoffe, die unter Cy-Bezeichnungen vermarktet werden, jedoch andere chemische Strukturen haben (wie in Abbildung 7 gezeigt). Eine Vielzahl von Analoga der standardisierten CY2/3/3.5/5/5.5/7/7.5-Farbstoffe wurde durch zahlreiche Modifikationsmethoden entwickelt, einschließlich Alexa Fluor Farbstoffen, DyLight Farbstoffen, FluoProbes Farbstoffen, Sulfo-Cy Farbstoffen, Seta Farbstoffen und IRIS Farbstoffen. Diese Farbstoffe sind in den meisten biochemischen Anwendungen mit CY-Farbstoffen austauschbar und bieten Verbesserungen bei Eigenschaften wie Löslichkeit, Fluoreszenz oder Photostabilität (wie in Abbildung 6 gezeigt). Die Strukturoformeln einiger dieser optimierten Farbstoffe wurden nach Ablauf des Patents veröffentlicht, während diejenigen anderer aufgrund laufender Patentschutz nicht offengelegt sind.

Abbildung 6 Entwicklungsdiagramm der Cyanin-Farbstoffe (mit gleicher Hauptkettenstruktur und optimierten/verbesserten Seitenketten)   

Abbildung 7 

Abbildung 8  Vergleich der Strukturoformeln von drei ähnlichen Farbstoffen FITC, Rhodamin und Alexa Fluor488

CY-Farbstoffe werden in nicht-sulfonierte Cyanin-Farbstoffe und sulfonierte Cyanin-Farbstoffe unterteilt, und beide zeigen sehr ähnliche Fluoreszenz-Eigenschaften (wie in Abbildung 9 dargestellt). Es gibt jedoch einige bemerkenswerte Unterschiede in ihren Markierungsprotokollen: (1) Nicht-sulfonierte Cyanine müssen vor dem Gebrauch in organischen Lösungsmitteln (Dimethylformamid, DMF; oder Dimethylsulfoxid, DMSO) gelöst werden und dann zur wässrigen Pufferlösung des Zielmoleküls hinzugefügt werden. Die empfohlenen Cosolvent-Volumina sind wie folgt: 10% für Cy3, Cy5 und Cy7 sowie 15% für die Gegenstücke von Cy3.5, Cy5.5 und Cy7.5. Sulfonierte Farbstoffe enthalten zusätzliche Sulfonsäure-Gruppen, was die Auflösung der Farbstoffmoleküle in der wässrigen Phase erleichtert. Die negativ geladenen Sulfonsäure-Gruppen reduzieren die Aggregation von Konjugaten, wenn der Farbstoff stark markiert ist, und die negative Ladung kann unspezifische Bindungen an nicht-zielpositive Biomoleküle minimieren (wie bestimmte Membranoberflächenproteine). (2) Unterschiede in der Reinigung: Wenn Dialyse-Reinigung mit wässrigen Pufferlösungen durchgeführt wird, müssen sulfonierte Cyanine verwendet werden, um eine effektive Entfernung von unreaktiven Farbstoffmaterialien zu erreichen. Die Reaktionen sowohl mit sulfonierten als auch nicht-sulfonierten Cyaninen können durch Gel-Filterung, Chromatographie (Hochleistungsflüssigkeitschromatographie, HPLC; schnelle Proteinflüssigkeitschromatographie, FPLC; oder Ionenaustausch) oder Elektrophorese gereinigt werden. (3) Bei der Markierung von DNA und Proteinen sind beide Farbstofftypen austauschbar und können zur Markierung von Biomolekülen verwendet werden. Sulfonierte Cyanine, die wasserlöslich sind und weniger zur Aggregation in Wasser neigen, sind die bevorzugte Wahl für Antikörper- und Proteinmarkierung. Nicht-sulfonierte Cyanin-Farbstoffe haben eine geringere Abhängigkeit ihrer Fluoreszenz-Eigenschaften von Lösungsmitteln und der Umgebung.

Abbildung 9  Spektroskopie sulfonierter und nicht-sulfonierter Cyanin-Farbstoffe

EnkiLife bietet eine Vielzahl von sulfonierten Cyanin-Farbstoffen und Kleinmolekül-Fluoreszenzfarbstoff-Markierungssätzen ähnlich wie Cyanin-Farbstoffe. Die Markierung von Antikörpern ist einfach, zuverlässig, schnell und einfach zu bedienen. Die markierten Protein-Antikörper können für verschiedene nachfolgende Anwendungen verwendet werden, wie Immunfluoreszenz, Durchflusszytometrie, ELISA usw.

   Im täglichen Leben hören wir oft über einen anderen Typ von Anthocyan-Farbstoffen, und der chinesische Name wird oft mit dem Namen Cyanin vermischt, der für Fluoreszenzmarkierung und Entwicklung verwendet wird. Um die beiden zu unterscheiden, wird eine weitere Erklärung gegeben.

1. Grundlegende Definition und Herkunft

2. Farbentwicklungsmechanismus und Stabilität

(1) Farbentwicklungsprinzip: 

• Anthocyanine: Abhängig von pH-Änderungen ändern sie ihre konjugierte Struktur durch intramolekularen Protonentransfer (wie Säure wird rot, basisch wird blau). 

• Cyanidin: Aufgrund der π-Elektronendelokalisierung der Poly(methyl)Alkyl-Kette ist die Absorptionswellenlänge lang (naher Infrarot-Bereich), und die Farbe wird durch Substituenten und Lösungsmittel beeinflusst. 

(2) Stabilität: 

• Anthocyanine werden leicht durch Licht, Hitze und Metallionen zerstört (müssen bei niedrigen Temperaturen und fern von Licht gelagert werden). 

• Cyanidin hat hohe Stabilität, aber einige Derivate (wie CY5) neigen zur Photobleaching und erfordern die Zugabe von Anti-Quenching-Agenten.

3. Vergleich der Anwendungsbereiche

4. Sicherheit und Umwelteinfluss

• Anthocyanin: Hohe Sicherheit, essbar und ungiftig; Hochgradig biologisch abbaubar und umweltfreundlich. 

• Cyanidin: Experimentelle Farbstoffe können aquatischen Organismen toxisch sein (unterliegen bestimmten Regulierungen).

5. Häufige Missverständnisse und Relevanz

• Namensverwirrung: Weil die Chinesische Transliteration ähnlich ist („grün" und „Cyanid"), aber die beiden sind chemisch nicht verwandt. 

• Cross-funktionales: Anthocyanine werden gelegentlich in einfachen pH-Teststreifen verwendet (natürliche Ersatzstoffe); Cyanidin-Derivate (wie Indocyanin-Grün) können für medizinische Bildgebung verwendet werden und sind nicht mit der biologischen Aktivität von Anthocyanen verwandt.

6. Zusammenfassung

Anthocyanine und Anthocyane sind grundlegend unterschiedlich: Ersteres ist ein natürliches Antioxidationspigment, das von Pflanzen entwickelt wurde, während Letzteres ein funktioneller Farbstoff ist, der von Menschen synthetisiert wird. Das Verständnis ihrer Unterschiede kann Verwirrung in Anwendungen vermeiden (wie die Verbots des Hinzufügens von synthetischen Cyanin-Farbstoffen in Lebensmitteln), gleichzeitig Materialien im biomedizinischen und industriellen Bereich genau auswählen.

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Hansun Hansun ist ein Proteinmarkierungsexperte bei EnkiLife, versiert in Immunologie, verschiedene Markierungstechniken und Durchflusszytometrie, gewidmet präziser Proteinmarkierung und Ermächtigung technologischer Durchbrüche. Jedes Protein verdient es, 'gesehen' zu werden.