Publikationen: Multiflokuläre Immunfluoreszenz für die Untersuchung des Tumorentumorsystems bei Malignant Colon-Cancer

Literaturübersicht: Multiplex-Immunofluoresenz für die Erforschung des Tumor-Mikromilieus von MCC (Merkelzellkarzinom)

Hintergrund

Merkel-zellkarzinom (MCC) ist ein aggressives kutanes neuroendokrines Karzinom, das primär ältere Erwachsene betrifft. Die Inzidenz ist bei immungeschwächten Individuen höher und tritt früher auf; es weist eine hohe Rate an Rezidiven, Metastasen und Mortalität auf, was eine effektive prognostische Bewertung und Behandlungsansätze erforderlich macht. MCC entwickelt sich über zwei distincte Wege: die meisten Tumore werden durch die klonale Integration des Merkel-zell-Polyomavirus (MCPyV) und die Expression von onkogenen viralen T -Antigenen angetrieben; MCPyV-negative Tumore entstehen aufgrund eines durch ultraviolettes Licht induzierten hohen Tumor-Mutationsburdens. Traditionelle Prädiktoren für Immunotherapie-Ergebnisse (wie PD-L1 -Expression und Tumor-Mutation-Burden) sind für MCC wirkungslos, während eine detaillierte Analyse des Tumormikromilieus (TME) das Behandlungsansprechen möglicherweise effektiver vorhersagen kann. Eine eingehende Erforschung MCC-assoziierter TME könnte neue alternative Behandlungsstrategien für Patienten bieten, die auf Immunotherapie nicht ansprechen oder intolerant sind.

Die Übertragung von Maus-bzw. murinen Tumorzellen in Mäuse mit dem gleichen genetischen Hintergrund ermöglicht eine präzise Beobachtung der Effekte von Immunmodulatoren auf Tumore und macht sie zu einem wichtigen Werkzeug für die Erforschung der Antitumor-Immunität. Daher nutzte die Studie "Development of a Multiplex Immunofluorescence Assay for Tumor Microenvironment Studies of Human and Murine Merkel Cell Carcinoma" von Sun L et al. Multiplex-Immunofluoreszenz (mIF) Technologie, um mehrere Marker gleichzeitig auf einem einzigen Gewebeschnitt zu visualisieren und eine standardisierte mIF-Detektionsmethode zur Untersuchung des TME von menschlichen und murinen MCC-Tumoren zu entwickeln.

Forschungsmethoden

Zunächst wurden ethisch genehmigte überschüssige menschliche MCC-Gewebe und murine MCC-Proben nach tierexperimentellen Richtlinien gesammelt und alle in Formalin-fixierte Paraffin-eingebettete (FFPE) Schnitte verarbeitet. Anschließend wurden mit dem wichtigsten MCC-Transkriptionsfaktor SOX2 als Haupttumormarker mIF-Experimente mit T-Zellen, Makrophagen und artspezifischen Funktionsmarkern konzipiert. Die mIF-Experimente wurden durch Bedingungen wie Primärantikörper-Konzentration, Antigen-Retrieving-Bedingungen, Färbereihenfolge und Fluorophor-Auswahl optimiert. Die manuelle Färbung wurde unter Verwendung des Opal 6-Plex-Kits durchgeführt, gefolgt von der Bildgebung auf der Mantra/Polaris-Plattform und Analyse mit InForm-Software. Schließlich wurde die Genauigkeit der Zellpopulationserkennung durch Vergleich mit entsprechenden Singleplex IHC-Ergebnissen und phänotypischer Analyse überprüft, und die Spezifität von Fluoreszenzsignalen sowie die Rationalität der räumlichen Verteilung wurden bewertet.

 Detektion der Lokalisierung primärer Antikörper (Monoklonale Antikörper-Färbung)

Obwohl Mikrowellenbehandlung in mIF-Detektion zur Elution von Primär- und Sekundärantikörpern verwendet werden kann, um Kreuzreaktivität oder Signalrückstände zu vermeiden, können einige Epitope nach mehreren Mikrowellenbehandlungen degradieren oder sogar verschwinden, während andere verstärkte Signale aufweisen können. Daher kann die Färbereihenfolge nicht willkürlich festgelegt werden, und die optimale Position für jeden Antikörper muss vorab bestimmt werden. Das Experiment verwendete positive Schnitte, die Zielmarker exprimierten, wobei Test-Primärantikörper in verschiedenen Färbepositionen im experimentellen Group arrangiert wurden und Puffer für Primärantikörper an die Primärantikörper-Positionen in der Kontrollgruppe gegeben wurden. Beide Gruppen durchliefen die gleiche Mikrowellenbehandlung und tauschten Fluorophore mit Fluorophor-Puffer aus. Anschließend wurde die Fluoreszenzintensität an jeder Position durch Fluoreszenzmikroskopie bewertet. Die Daten in der Abbildung zeigen klar das Signalverhalten von Markern bei verschiedenen Färbepositionen, wobei die Position mit positiver Zell-Signalintensität mindestens 5-10 Mal dem Hintergrund bestimmt wurde.

MurinesmIF Marker-Auswahl und Färbungsverifikation

Die Abbildung zeigt die Fluorophor-Zuordnung und Anwendungseffekte von Markern in murinen MCC-Tumorschnitten. SOX2 wurde mit dem Fluorophor niedrigerer Helligkeit Opal 690 gepaart aufgrund seines hohen Expressions-Reichtums; das Signalintensitäts- und Färbepositionsverhalten von FOXP3 unterstützte die Paarung mit Opal 780; der Makrophagenmarker F4/80 wurde mit Opal 480 gepaart, trotz hoher Autofluoreszenz im entsprechenden Kanal, da sein Signalverhalten stabil war; Arg1 wurde mit Opal 620 gepaart, um den Färbepositionsabstand zu F4/80 zu maximieren; CD3 und CD8 wurden mit Opal 520 bzw. Opal 570 gepaart. Die Abbildung zeigt klar die Multiplex-Färbungsbilder und Einzelkanalbilder in murinen MCC-Tumorproben. Gleichzeitig waren die Multiplex-Färbungsergebnisse von 4 zusätzlichen murinen MCC-Tumorproben diesen ähnlich, und die Multiplex-Färbungsergebnisse stimmten mit den Singleplex IHC-Ergebnissen jedes Markers überein, wobei die phänotypische Analyse erwartete Zellpopulationen genau detektierte.

 HumanesmIF Marker-Auswahl und Färbungsverifikation

Die Abbildung zeigt die Fluorophor-Zuordnung und Anwendungseffekte von Markern in humanen MCC-Tumorproben. Im Gegensatz zu Maus-Proben wurden CD3 und SOX2 als Hochabundanz-Antigene mit schwachen Fluorophoren Opal 780 und Opal 690 jeweils gepaart; FOXP3 mit schwacher Expression wurde mit dem hellen Fluorophor Opal 520 gepaart; der Makrophagenmarker CD163 wurde als stabil exprimiert vorhergesagt, daher wurde er mit Opal 480 gepaart, um Autofluoreszenz-Störungen im Gewebe zu tolerieren; PD-L1 wurde mit Opal 620 gepaart, und CD8 wurde mit Opal 570 gepaart, um eine Färbepositionstrennung von CD163 und CD3 zu erreichen. Obwohl CD3 in der finalen Sequenz nach CD8 positioniert wurde, was theoretisch ein räumliches Hindernisrisiko aufwies, zeigte die phänotypische Analyse, dass der Großteil der CD8+-Zellen das Co-Expression von CD3+ ohne Klassifikationsfehler aufwiesen. Die Abbildung zeigt klar die Multiplex-Färbungsbilder und Einzelkanalbilder in humanen MCC-Proben, und Färbungsergebnisse, die auf 3 zusätzlichen Proben angewendet wurden, waren diesen ähnlich.

Ergebnisanalyse mittels Inform

Der Analyseprozess ist in vier Schritte unterteilt: der erste Schritt besteht darin, jeden Färbekanal einzeln, in spezifischen Kombinationen und als Ganzes zu betrachten; der zweite Schritt ist die Zellsegmentierung, wobei Regionen im Bild definiert werden, die einzelne Zellen repräsentieren; der dritte Schritt ist die phänotypische Klassifizierung, bei der Marker-Ausdrucksmuster durch vom Benutzer trainierte Algorithmen interpretiert werden, um Phänotypen jeder Zelle zuzuweisen, wobei farbige Punkte Zellpopulationen verschiedener Phänotyp darstellen; der vierte Schritt ist die quantitative Analyse, die die Anzahl jeder Zellpopulation zählt. Ergebnisse zeigen, dass trotz schwacher Hintergrundlabelierung von Tumorzellen im Opal 780-Kanal SOX2+-Tumorzellen dennoch korrekt durch die oben beschriebene digitale phänotypische Analyse klassifiziert werden können und echte CD3-Expressions-Signale auf T-Zellen von unspezifischen falschen Signalen auf Tumorzellen effektiv unterscheiden. Die Färbereihenfolge von CD3 und CD8 in sowohl humanen als auch murinen Tumorgeweben ist eng, theoretisch mit räumlichen Hindernisrisiken behaftet, aber die nachfolgende Multiplex-Marker-CD3+/CD8+-Co-Expression-Detektion, die in R-Software durchgeführt wurde, detektierte keine signifikant CD3-/CD8+-Zellen, was auf kein falsches Detektionsergebnis aufgrund von räumlichen Hindernissen hindeutet und die Detektionsgenauigkeit sicherstellt. Darüber hinaus sind mIF-Schnitte beider Tumorgewebe für diese Analysemethode geeignet.

Literatur

Sun L, Verhaegen ME, McGue J, Olivei AC, Dlugosz AA, Frankel TL, Harms PW. Development of a Multiplex Immunofluorescence Assay for Tumor Microenvironment Studies of Human and Murine Merkel Cell Carcinoma. Lab Invest. 2024 Oct;104(10):102128. doi: 10.1016/j.labinv.2024.102128. Epub 2024 Aug 23. PMID: 39182611; PMCID: PMC11502254.   

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