JC-1
Das Prinzip der JC-1-Detektion
JC-1 (auch bekannt als CBIC2 (3)) ist ein fluoreszierender Sondentyp zur Detektion des mitochondrialen Membranpotenzials (Δ Ψm). Seine Molekülformel lautet C25H27Cl4IN4, das Molekulargewicht beträgt 652,23, die CAS-Nummer ist 3520-43-2 und die Reinheit liegt über 95 %. Diese Substanz wird weit verbreitet zur Detektion des Membranpotenzials in Zellen, Geweben oder gereinigten Mitochondrien verwendet.
JC-1 spiegelt den Zustand des mitochondrialen Membranpotenzials durch Farbänderungen der Fluoreszenz wider: Bei hohem Potenzial aggregiert es in der Mitochondrien-Matrix zu J-Aggregaten, die rote Fluoreszenz emittieren (Anregungs-/Emissionswellenlänge 585/590 nm), und bei niedrigem Potenzial liegt es in monomerer Form vor und emittiert grüne Fluoreszenz (Anregungs-/Emissionswellenlänge 514/529 nm). Das Verhältnis der roten zu grünen Fluoreszenzintensität kann als Indikator für die Mitochondrien-Depolarisation verwendet werden und wird häufig zur Detektion von Fluoreszenzänderungen genutzt, die durch Membranpotenzialabfall in der frühen Phase der Zellapoptose verursacht werden. Diese Eigenschaft macht es zu einem wichtigen Werkzeug zur Erforschung der mitochondrialen Funktion und Apoptosemechanismen.
Der Abfall des mitochondrialen Membranpotenzials ist ein Kennzeichenereignis in der frühen Phase der Zellapoptose. Der Übergang von JC-1 von roter zu grüner Fluoreszenz ermöglicht die einfache Detektion des Abfalls des Zellmembranpotenzials, und dieser Übergang kann auch als früher Detektionsindikator für die Zellapoptose verwendet werden.
JC-1 mitochondriales Membranpotenzial-Detektionsprotokoll
Vorbereitung vor dem Experiment
1. Materialien und Reagenzien
- JC-1-Sonde, Kulturmedium, Reagenzset, ultrapures Wasser
- JC-1-Färbepuffer, PBS-Puffer etc.
2. Ausrüstung
- Fluoreszenzmikroskop (ausgestattet mit 488 nm Anregungslicht, fähig zur Detektion von 530 nm und 590 nm Fluoreszenz), Durchflusszytometer (Einstellung auf 488 nm Anregungslicht, FL-1-Kanal detektiert grüne Fluoreszenz bei 530 nm, FL-2-Kanal detektiert rote Fluoreszenz bei 590 nm), Temperaturkontrollausrüstung (37 ℃ Inkubator), Pipette
3. Zellvorbereitung
Sicherstellen, dass Zellen sich in der logistischen Wachstumsphase befinden, um den optimalen Membranpotenzialzustand zu erreichen.
Experimentelle Schritte
1. Herstellung der JC-1-Färbearbeitslösung
Nach den Anweisungen des Kits das JC-1-Probe in DMSO auflösen und mit serumfreiem Medium auf die gewünschte Konzentration verdünnen (in der Regel 2,5-10 µg/mL).
Jedes Fach des Sechszellplatten erfordert 1 mL Färbearbeitslösung, und das Zellsuspension benötigt 0,5 mL Färbearbeitslösung für jeweils 500.000 bis 1 Million Zellen.
Sicherstellen, dass JC-1 vollständig gelöst und gemischt ist.
2. Zellfärbung
Eine geeignete Menge an JC-1-Arbeitslösung zum Zellkulturmedium hinzufügen und vorsichtig mischen.
Zellplatte in einem 37 ℃, 5% CO2-Inkubator für 15-30 Minuten inkubieren (anpassungsspezifisch nach Zelltyp).
Nach der Färbung die Zellen 2-3 mal mit vor gekühltem PBS waschen, um ungebundene Proben zu entfernen.
3. Zellverarbeitung
Für adhäsive Zellen die Zellsuspension nach milder Behandlung mit Trypsin sammeln.
Für suspendierte Zellen nach den Schritten resuspendieren, inkubieren, zentrifugieren und waschen.
Schließlich die Zellen in JC-1-Färbepuffer resuspendieren und zur Detektion vorbereiten.
4. Detektion und Datenerfassung
Fluoreszenzmikroskop-Detektion: Zellen beobachten mit Anregungswellenlänge von 488 nm, roter Fluoreszenz-Emissionwellenlänge von 590 nm und grüner Fluoreszenz-Emissionswellenlänge von 530 nm. Gesunde Zellen zeigen rote Fluoreszenz, während geschädigte Zellen grüne Fluoreszenz zeigen.
Durchflusszytometrie-Detektion: Das Verhältnis der roten-grünen Fluoreszenz des Zellpopulation messen, das rotes/grüne Fluoreszenzverhältnis berechnen, um Veränderungen im mitochondrialen Membranpotenzial zu bewerten.
Ergebnisanalyse
Einen roten-grünen Fluoreszenzverdiagramm durch Software-Analyse generieren.
Wenn durch Durchflusszytometrie detektiert, sind FL-1+ und FL-2+ normale Zellen, während FL-1+ und FL-2- apoptotische Zellen sind.
Vorsichtsmaßnahmen
1. Auflösung und Konservierung von JC-1:
JC-1 verfestigt sich bei niedrigen Temperaturen und muss vor der Verwendung in einem Wasserbad bei 20-25 ℃ gelöst werden.
Nach Abschluss der Färbung versuchen, den Test innerhalb von 30 Minuten abzuschließen, und nicht genutzte Färbelösung sollte in einem Eisbad gespeichert werden.
2. Betriebsbedingungen:
Bewahren Sie 37 ℃ während des Färbeprozesses bei, um Temperaturschwankungen zu vermeiden.
Während des Waschens JC-1-Färbepuffer bei ca. 4 ℃ halten, um bessere Waschergebnisse zu erreichen.
3. Experimentelle Wiederholbarkeit und Zuverlässigkeit:
• Einfluss externer Faktoren (wie pH-Änderungen und Temperaturschwankungen) auf Zellen vermeiden.
PH-Konsistenz von JC-1-Färbepuffer sicherstellen.
4. Sicherheit und Kompensationsanpassung:
Beim Verwenden von CCCP (Mitochondrien-Elektronentransportkettenehemmer) sollten Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden.
Beim Verwenden eines Durchflusszytometers zur Detektion auf Kompensationsanpassung achten und Kompensations-Mikrokugeln oder FITC/PE-Färbeantikörper für Kalibrierung verwenden.
FAQ zur JC-1-Detektion
Sicherlich, aber es ist nicht möglich, das Gewebe direkt zu detektieren. Das Gewebe kann zunächst als Einzelzell-Suspension hergestellt werden und dann nach den Schritten zur Suspension von Zellen getestet werden. Außerdem ist es wichtig zu beachten, dass der Prozess der Herstellung von Einzelzell-Suspensionen leicht Schäden an Zellen verursachen kann, und der Herstellungsplan muss erforscht werden, um falsche Positive durch Veränderungen des mitochondrialen Membranpotenzials aufgrund von Zellverdauung zu vermeiden; Mitochondrien können auch aus Geweben extrahiert werden, mit JC-1 inkubiert werden, und die experimentellen Ergebnisse können mit einem Fluoreszenz-Enzymverbund-Immunosorbent-Assay (ELISA)-Leser detektiert werden.
Nicht empfohlen. Der Kontakt zwischen adhäsiven Zellen kann zu ungleichmäßigen Kontakten zwischen Zellen und Farbstoffen führen, was den Eintritt von JC-1-Farbstoff in Zellen beeinflussen kann, insbesondere wenn das Zellwachstum dicht ist. Empfehlen die Verdauung von Zellen vor der Inkubation mit JC-1.
Nein, die Probe für das JC-1-Experiment muss lebende Zellen sein.
Nein, JC-1 wird zur Detektion von lebenden Zellproben verwendet und Zelltod tritt nach der Fixierung auf; Zusätzlich kann das zu lange Belassen nach der Färbung zur Fluoreszenz-Ausblendung führen. Es wird empfohlen, die Detektion innerhalb von 30 Minuten nach der Färbung abzuschließen.